**************************************（1）慢冻程序：程序降温盒：1℃/min降温4℃-20℃-80℃液氮（2）低温保护剂的应用：2、细胞的冻存在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第62页，共77页，星期日，2025年，2月5日（3）细胞冻存方法预先配制冻存液：含血清培养基，10%DMSO。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液。加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。第63页，共77页，星期日，2025年，2月5日从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，摇动使其融化（1分钟左右）。用培养液稀释至原体积的10倍以上。低速离心5分钟。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。隔天观察细胞生长情况，并换液。3、细胞的复苏第64页，共77页，星期日，2025年，2月5日第六节动物细胞大量培养的方法
和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。1、悬浮培养优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：由于细胞体积小，较难采用灌流培养。*第65页，共77页，星期日，2025年，2月5日2、贴壁培养优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第66页，共77页，星期日，2025年，2月5日3、贴壁-悬浮培养（1）微载体培养将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。优点：1、可创造相当大的贴附面积，2、载体体积较小，比重较轻，轻度搅拌即可携带细胞悬浮于培养基内，发挥悬浮培养的特长。第67页，共77页，星期日，2025年，2月5日微载体的条件１.表面性质与细胞有良好的相容性２.微载体的材料无毒性３.微载体的材料是惰性的４.微载体的比重在1.030～1.045g/ml５.粒径在60～250μm之间，且均一６.具良好的光学透明性７.基质软８.耐高温９.可反复使用10.原料充分，制作简便，廉价第68页，共77页，星期日，2025年，2月5日（2）包埋和微曩培养优点：1.包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；2.可以获得较高的细胞密度；3.通过控制微曩膜的孔径，可使产品浓缩在微曩内，有利于下游产物的纯化处理；4.可采用多种生物反应器进行大规模培养将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。第69页，共77页，星期日，2025年，2月5日（3）结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养。优点：操作简单、节省微载体成本。第70页，共77页，星期日，2025年，2月5日二、动物细胞培养的操作方式1.分批式操作分批式培养中，细胞接种于固定体积的培养基中，随着细胞的增殖，营养物质消耗，代谢产物累积。最后，营养耗尽，细胞增殖停止。改进：通过培养基的各种补加方式，提高产量。第71页，共77页，星期日，2025年，2月5日2.半连续式操作间断以新鲜培养基（或连同新鲜载体一起）更换固定体积培养基（或连同细胞载体一起），继续培养。３.灌流式操作通过不断向培养系统中加入新鲜培养基并且从反应器中打出已经使用过的培养液（无细胞）。第72页，共77页，星期日，2025年，2月5日工业化细胞培养的发展趋势以高密度连续灌流培养代替间歇批式培养以生物反应器系统代替手工操作的转瓶或方瓶培养系统以悬浮培养技术代替贴壁培养技术以无血清培养代替有血清培养第73页，共77页，星期日，2025年，2月5日第七节动物细胞制药的前景与展望一、改进表达载体，提高表达水平和产量提高细胞表达的水平，主要靠对表达系统的改造。包括：采用更强的启动子和增强子更好的利用扩增系统或寻找高表达位点采用和改造更好的宿主细胞第74页，共77页，星期日，2025年，2月5日