1．操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果,进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日2．操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日3．在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日4．工具用后及时消毒，避免交叉污染。5．工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日6．由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。。第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日氮不足时，培养的组织常表现出花色苷的颜色（红、紫红色），愈伤组织内部很难看到导管分子的分化；氮、钾或磷不足时，细胞会明显过度生长，形成一些十分蓬松，甚至是透明状的愈伤组织；铁、硫缺少时组织会失绿，细胞分裂停滞，愈伤组织出现褐色衰老症状；缺硼时细胞分裂趋势缓慢，过度伸长；缺少锰或铝时细胞生长受到影响。第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日3.2灭菌技术1.有菌范畴：凡是暴露的物体，接触水源的物体，其表面都有菌。依此未处理的无菌室、超净台表面、未灭菌的培养基、容器表面、接种刀剪、身体外表及呼吸道等，都是有菌的。2.菌的种类及特点：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。3.无菌范畴：经高温灼烧或一定时间蒸煮等物理方法处理，或化学药剂处理，高层大气、岩石内部、健康组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等。第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日4灭菌:指用理化方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。5消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，即不会完全杀死，还有活着的微生物。第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日6无菌操作：在通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台等）和使用的器皿内，以及操作者外表都不带任何活着的微生物条件下，进行操作叫做无菌操作。7组培无菌的要求：必须彻底无菌，比微生物培养还严格，因为培养基营养丰富，温度和湿度等合适。要彻底灭菌，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌。第33页，共93页，星期日，2025年，2月5日灭菌技术处理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌过滤、离心沉淀等
化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌
1．培养基灭菌
2．玻璃器皿灭菌
3．金属用具灭菌
4．接种室灭菌
5．外植体灭菌第34页，共93页，星期日，2025年，2月5日培养基一般采用高压蒸气灭菌培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积（ml）灭菌温度（°C）灭菌时间（min）20-501212050-50012125500-500012535第35页，共93页，星期日，2025年，2月5日材料消毒基本原则:有良好的杀菌消毒效果，易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，同时不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用试剂的时候需考虑使用浓度和处理时间。第36页，共93页，星期日，2025年，2月5日常用消毒剂消毒剂使用质量分数（%）去除难易消毒时间(min)消毒效果有否毒害植物次氯酸钙9-10易5-30很好低毒次氯酸钠2易5-30很好无过氧化氢10-12最易5-15好无硝酸银1较难5-30好低毒氯化汞0.1-1较难2-10最好剧毒酒精70-75易0.2-2好有抗生素4-50中30-60较好低毒第37页，共93页，星期日，2025年，2月5日次氯酸钠和次氯酸钙在使用前临时配制，都是利用其分解产生氯气来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖较好；灭菌效