4、旋转管培养法将组织细胞接种在培养管内，置于可旋转的支架（旋转鼓）上，边旋转边培养。优点：培养液均一性好，有利于细胞生长与物质交换；缺点：培养管的球面不利于观察。第71页，共108页，星期日，2025年，2月5日5、培养板培养法将组织细胞接种在培养板内，置于培养箱中培养。是现代培养技术中最常用的方法。培养板规格：2孔、4孔、6孔、24孔、48孔、96孔等；优点：可进行微量培养、使培养容积标准化、可进行组间比较；缺点：成本较高。第72页，共108页，星期日，2025年，2月5日6、灌流小室培养法将细胞接种在一个由上、下两张盖玻片和一个用金属圈密封围成的小室内，然后将整个小室保持在恒温下，使细胞在盖玻片上生长。在小室的侧壁分别有液体流入和排出的开口，新鲜培养液不断地灌注进小室，旧的培养液则不断流出小室。优点：能保持培养液的不断更新，有利于细胞生长与物质交换，有利于获得高浓度的产物；缺点：操作繁琐、难度较高。第73页，共108页，星期日，2025年，2月5日第74页，共108页，星期日，2025年，2月5日二、原代培养与传代培养技术动物细胞培养中，幼龄组织优于老龄组织，分化程度低的优于分化程度高的，但均从原代培养开始。?原代培养方法：组织块培养法和组织消化培养?A组织块培养法：采取动物的组织或器官，剪碎组织，平衡盐溶液(BSS)冲洗，低速离心，然后洗涤接入培养瓶。第75页，共108页，星期日，2025年，2月5日?B组织消化培养：第76页，共108页，星期日，2025年，2月5日一、细胞体外生长的要求环境要求营养要求第39页，共108页，星期日，2025年，2月5日1、细胞培养的环境要求温度pH值气体渗透压思考：主要考虑哪些环境因素？第40页，共108页，星期日，2025年，2月5日1）、温度：不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为37度；细胞对低温的耐受力比高温强。温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。第41页，共108页，星期日，2025年，2月5日CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。第42页，共108页，星期日，2025年，2月5日2）、pH值：动物细胞培养最适pH值为7.2-7.4，低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对一定范围的pH值改变有抵抗力。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。第43页，共108页，星期日，2025年，2月5日3）、气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。4）、渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。第44页，共108页，星期日，2025年，2月5日2、细胞培养的营养要求动物细胞培养营养要求高，培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液。分天然培养基和合成培养基。第45页，共108页，星期日，2025年，2月5日1）、天然培养基：来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）等；优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求；缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生支原体污染。第46页，共108页，星期日，2025年，2月5日2）、合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。优点：能够标准化生产，组分和含量相对固定，成本低；缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量（10-15%）的血清，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。第47页，共108页，星期日，2025年，2月5日人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基