血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
血清清蛋白、γ－球蛋白得分离、提纯与鉴定
一、实验目得
掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质得原理和基本方法;
掌握醋酸纤维素薄膜电泳法得原理和基本方法;
了解柱层析技术。
二、实验原理
血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要得功能。
本实验利用盐析方法将血清中得清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果。
１、盐析
蛋白质分子能稳定存在于水溶液中就就是因为有两个稳定因素:表面得电荷和水化膜。当维持蛋白质得稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出得方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏得不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法得原理就就是:中性盐如硫酸铵((NH４)２SO４)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜,并且中和了部分电荷,从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子得颗粒大小、所带电荷得多少和亲水程度不同,故盐析所需得盐浓度也不同,因此调节盐得浓度可使不同得蛋白质沉淀从而达到分离得目得。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀,而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀,利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来,即在半饱和得中,血清蛋白不沉淀,而血球蛋白沉淀,离心后清蛋白主要在上清液中,沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解,由此达到分离清蛋白和白蛋白得目得。
脱盐
盐析得到得蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留得中性盐,常用方法有:透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐得分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大得蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间得间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐得分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱得时间较后。分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐得蛋白质。
纯化(离子交换层析)
离子交换就就是溶液中得离子和交换剂上得离子进行可逆得得交换过程。带正电荷得交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷得交换剂称为阳离子交换剂。
本实验采用得ＤEＡE纤维素就就是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷得离子可与其进行交换结合,带正电荷得点正电荷得离子则不能,这样便可达到分离纯化得目得。
脱盐后得蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用她们得等电点得不同可进行分离。血清中各种蛋白质得pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带得电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。
纯度鉴定(电泳)
血清中各种蛋白质得等电点不同,一般都低于pH7、4。她们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将她们分离为清蛋白(Albｕｍin)、α1-球蛋白、α２－球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白５条区带。
三、材料与方法:以流程图示意
1、实验材料
人血清、葡聚糖凝胶G－2５(SｅpｈadexＧ-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、０、3mｏｌ/l得PＨ6、5醋酸铵缓冲液、0、０６mol/l得PＨ6、５醋酸铵缓冲液、0、０2mol／l得ＰH6、５醋酸铵缓冲液、1、5ｍｏl/l得ＮaCl-0、3ｍｏl／NH4ＡC溶液、２０%磺基水杨酸、1%BａＣl2溶液、电泳仪、电泳槽。
实验方法
实验流程
纯化鉴定脱盐粗提
纯化
鉴定
脱盐
粗提
DEAE纤维素离子交换层析醋酸纤维素薄膜电泳葡聚糖凝胶层析盐析法进行粗分离
DEAE纤维素离子交换层析
醋酸纤维素薄膜电泳
葡聚糖凝胶层析
盐析法进行粗分离
实验步骤
盐析:中性盐沉淀步骤
步骤
操作
(1)盐析
取离心管一个,加入0、8mｏｌ人或动物血清,边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0、8ml,混匀后室温下放置10ｍｉn,离心10ｍin(４000r／mｉn)。用滴管小心吸出上清液置于试管中,作为纯化清蛋白之用
(2)溶解沉淀
向离心管得沉淀加入０、6moｌ蒸馏水,振摇使之溶解,作为纯化γ球蛋白用
注意:上层清夜尽量全部吸出,但不可吸出沉淀物。
脱盐:过凝胶层析柱步骤
步骤
操作
(１)调节层析柱液面
葡萄糖凝胶G-2５层析柱经0、0２mol/L、pＨ６、5NＨ４AＣ缓冲液流洗平衡后,取下恒压储液瓶管塞,小心控制柱下端螺旋夹,使层析柱上得缓冲液面刚好下降到凝胶床液面
(2)加样品
用细长滴管吸取上述经盐析所得得粗制蛋白质溶液,小心而缓慢得加入凝胶床上面,