第1页，共32页，星期日，2025年，2月5日质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞一定的表型。?第2页，共32页，星期日，2025年，2月5日质粒DNA提取、鉴定
暨大医学院生化系蒋建伟第3页，共32页，星期日，2025年，2月5日质粒分类：严紧型（每个细胞1－5个质粒）质粒的复制与宿主染色体复制同步进行，因而一个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。当宿主蛋白合成被抑制，染色体复制停止，质粒的复制也停止；松弛型（每个细胞10－200个质粒）质粒的复制受“松弛型控制”。当宿主蛋白质合成受抑制（如加入氯霉素），染色体复制停止时，质粒仍可大量复制。此时，一个宿主细胞中质粒数目可多至数千个拷贝。第4页，共32页，星期日，2025年，2月5日具备基因工程质粒载体的条件：①多克隆位点（multiplecloningsite,MCS),一段短的序列上有多种限制性内切酶切口，每种只有一个切口。②选择性标记，如抗药性。③本身分子量不宜过大，有一定容量。④有一定的copynumber——每个宿主菌可能容纳的最多质粒数。第5页，共32页，星期日，2025年，2月5日pBR322质粒(4.36kp),最早应用于基因工程的载体，现在仍在广泛应用。?序列已全部清楚?数十个内切酶位点?2个抗药基因第6页，共32页，星期日，2025年，2月5日pBR322质粒(4363bp):主要包括：①限制性内切酶位点（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。第7页，共32页，星期日，2025年，2月5日第8页，共32页，星期日，2025年，2月5日pUC18/19pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与Ｍ13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体。质粒含有LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。第9页，共32页，星期日，2025年，2月5日α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段第10页，共32页，星期日，2025年，2月5日本次实验用pEC-CTpEC-CT在pcDNA3基础上构建pEC-ct质粒：8.0kb有HindⅢ,BamHⅠ酶切点，可切出CD基因（1.2kb）第11页，共32页，星期日，2025年，2月5日质粒DNA提取和纯化步骤：培养细菌收集和裂解细菌纯化质粒DNA第12页，共32页，星期日，2025年，2月5日接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37℃培养24h单克隆培养：挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp50μg/ml)4-6h。菌液0.2ml＋10mlLB培养基（含Amp50μg/ml)37℃培养过夜。细菌的培养
第13页，共32页，星期日，2025年，2月5日3.扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50μg/ml),振摇200rpm，37℃(4-6h),使A580＝0.4-0.6。4.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40μg/ml，继续培养15-17h.第14页，共32页，星期日，2025年，2月5日本次实验包括：1.菌体收集2.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化3.鉴定2人一组第15页，共32页，星期日，2025年，2月5日1.取8个1.5mlEppendorf管，分别加入细菌培养液1.4ml↓9000rpm2-3min↓↘弃上清2.600μlSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管再用200μlSTE液清洗各管，清洗液合并一管（收集菌体）↓9000rpm2-3min,弃上清（保留菌体）收集菌体600ul第16页，共32页，星期日，2025年，2月5日3.沉淀悬于200ul溶液I，