大肠杆菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为400gDCW/L（DCW：drycellweight），相对于发酵液中25%是大肠杆菌细胞。迄今为止，最高密度发酵的两个例子是非重组菌E.coliW3110（密度为174gDCW/L）；生产聚-3-羟基丁酸的重组菌（密度为175.4gDCW/L）第88页，共160页，星期日，2025年，2月5日影响大肠杆菌高密度发酵的因素发酵培养基：碳氮比；碳源氮源浓度表达基因的调控宿主菌质粒拷贝数和稳定性诱导时间和诱导强度大肠杆菌高密度发酵的补料调控：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料乙酸对生长和表达的影响：减少乙酸第89页，共160页，星期日，2025年，2月5日酵母菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为280gDCW/L（DCW：drycellweight），目前发酵过程中，一般认为酵母密度为100~200gDCW/L即为高密度发酵。常用高密度发酵宿主菌是巴氏毕赤酵母第90页，共160页，星期日，2025年，2月5日毕赤酵母高密度培养技术首先用含甘油的合成培养基培养，外源基因的表达被完全抑制。当甘油消耗完，开始流加甘油至培养物种，使细胞限速生长。最后流加甲醇或甲醇与甘油混合物，诱导外源基因表达，同时检测培养液中的外源蛋白浓度，到适当水平停止发酵和收获目的蛋白。第91页，共160页，星期日，2025年，2月5日实例：表达重组人血清白蛋白（rHSA）毕赤酵母工程菌高密度培养在15L多参数全自动发酵罐中，OD600达500~700，密度达115~160gDCW/L，rHSA蛋白表达量达3.6g/L。工艺：22h分批发酵结束后，开始流加补料发酵培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在46h达到OD值700，达到高密度，停止流加。当DO陡然上升到70%，开始流加诱导表达培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在120h，rHSA表达量最大达到3.6g/L。第92页，共160页，星期日，2025年，2月5日（四）影响基因工程菌培养的各种因素分析基因工程菌 传统微生物生物材料 含外源重组基因 不含外源重组基因发酵工艺 使外源基因高效表达使自身基因表达目的 产生外源蛋白质产生自身的代谢产物
1、培养基的影响2、接种量的影响3、温度的影响4、溶解氧的影响5、诱导时机的影响6、PH值的影响第93页，共160页，星期日，2025年，2月5日1、培养基的影响（1）常用的碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、制定水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。（3）其它组成成份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。（4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。第94页，共160页，星期日，2025年，2月5日2、接种量的影响接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。（1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。（2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。（3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。第95页，共160页，星期日，2025年，2月5日3、温度的影响温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。（1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。（2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。（3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。（4）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。举如说明如下第96页，共160页，星期日，2025年，2月5日温度影响的例子（1）大肠杆菌合成青霉素酰化酶，从37℃起随着温度的下降，青霉素酰化酶的合成产量逐渐增加，20℃--22℃时达到高峰，16℃以下，青霉素酰化酶的产量反而下降。这是由于在18℃--16℃时，工程菌生长减慢。实验证明，造成这种减慢的原因是由于温度影响了细胞内青霉素酰化酶mRNA的浓度。（2）分泌型人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coli—W3100/pGM-CSF，在30℃时，蛋白质表达量最高，37℃时，由于细菌的热休克系统被激活，其蛋白质表达量反而下降。（3）重组人生长激素工程菌，在3