实验四
种子生活力的快速测定
一、实验目的
熟悉种子活力快速测定的各种方法，掌握氯化三苯基四氮唑法(TTC法)、溴麝香草酚蓝法(BTB法)和红墨水法测定种子生活力的方法。二、实验原理TTC法：凡有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，便由无色TTC变为红色的三苯基甲??（zā）(TTF)。二、实验原理BTB法：凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO3，H2CO3解离成H+和HCO3-，使得种胚周围环境的酸度增加，可用溴麝香草酚蓝法(BTB法)来测定酸度的改变。BTB的变色范围为pH6.0-7.6，酸性呈黄色，碱性成蓝色，中间经过绿色(变色点为pH7.1)。色泽差异显著，易于观察。二、实验原理红墨水法：有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后，染料大分子不能进入活细胞内，所以胚部等活组织不能被染料染色，而死的种胚细胞内原生质膜丧失选择吸收能力，故可被染料染色。三、仪器、材料和试剂（一）实验仪器恒温箱，烧杯，培养皿，镊子，刀片，天平，漏斗，滤纸，琼脂（二）实验试剂0.5%TTC溶液：称取0．5gTTC放在烧杯中，加入少许95％乙醇使其溶解然后用蒸馏水稀释至100mL。溶液避光保存，若变红色，即不能再用。0.1%BTB溶液：称取BTB0.1g溶解于煮沸过的自来水中(配制指示剂的水应为微碱性，使溶液呈蓝色或蓝绿色，蒸馏水为微酸性不宜用)，然后用滤纸滤去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴稀氨水，使之变为蓝色或蓝绿色。此液贮于棕色瓶中可长期保存。1%BTB琼脂凝胶(取0.1%BTB溶液100mL置于烧杯中，将琼脂剪碎后加入，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在数个干洁的培养皿中，使成一均匀的薄层，冷却后备用。5%红墨水：体积比（三）实验材料小麦种子四、实验步骤1．浸种将待测种子在30-35℃温水中浸种(大麦、小麦，籼谷6、8h，玉米5h，粳谷2h)，以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。2．显色取吸胀的种子30粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半，将其中的一半置于1只培养皿中，每皿30个半粒，加入适量的0.5％TTC，覆盖种子为度，置于30℃恒温箱中0.5-1h，观察结果，凡胚被染成红色的是活种子。另一半置于另一只培养皿中，加入5%红墨水染色3-5分钟后流水冲洗至无颜色，凡胚被染成红色的是死种子。3．计算活种子的百分率。氯化三苯基四氮唑法(TTC法)1.浸种同上述TTC法。2.显色取吸胀的种子30粒，整齐地埋于准备好的琼脂凝胶培养皿中，种子平放，间隔距离至少1cm。然后将培养皿置于30-35℃下培养2-4h，在蓝色背景下观察。如种胚附近呈现较深黄色晕圈的是活种子，否则是死种子。种子插入培养皿底部，可在底部观察；或者去掉种子，观察种子周围黄色。3.计数种胚附近出现黄色晕圈的活种子数，算出活种子百分率。溴麝香草酚蓝法(BTB法)五、作业1.分别计算三种方法测得的活种子的百分率。2.比较TTC法和红墨水法哪种方法更精确？3.比较三种方法的优缺点。