实验三
光合色素的提取及理化性质的测定
一、实验目的
以植物叶片组织为材料，提取叶绿体色素；以纸层析法分离其成分；鉴定叶绿体色素的理化性质。二、实验原理提取：叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。分离：当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。理化性质的观察：叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。叶绿素的荧光现象透射光反射光叶绿素是一种二羧酸酯,在弱酸作用下，叶绿素中镁可被H+取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为暗绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。取代反应三、仪器、材料和试剂（一）实验仪器天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等（二）实验试剂丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚:丙酮=25:3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜、盐酸（三）实验材料菠菜四、实验步骤1.叶绿体色素的提取（1）取新鲜菠菜叶片2克，擦干，去中脉，剪碎放入研钵；（2）加入少许石英砂和CaCO3，再加入无水丙酮10mL，研磨成匀浆，再加丙酮15mL；（3）用漏斗滤去残渣，得叶绿体色素提取液(置于暗处)。2.纸层析分离叶绿体色素（1）层析样纸制备，将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条，将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的窄条；（2）点样，用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部，用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次；（3）展层，在层析缸中加入3-5mL层析推动液，然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内，调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中，盖好盖子，于阴暗处展层约10min，即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层3.叶绿体理化性质的观察荧光现象的观察：取浓的叶绿体色素提取液化3mL，在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色。皂化作用：在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加入2mL的20%KOH-甲醇溶液，充分混匀，吹打5分钟；沿试管壁缓慢加入3mL乙醚+4mL的蒸馏水，边滴加边摇动，直至看到溶液逐渐分为两层为止。对照不加KOH-甲醇溶液。叶绿素分子中Mg2+的取代作用：取2只试管，分别加入2mL叶绿体色素提取液，第1只作为对照，第2只加入数滴5%HCl，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，并微加热。与对照比较，观察溶液颜色变化，并解释原因。五、实验作业1.纸层析分离叶绿体色素实验中，用铅笔在层析纸上指出4种色层的轮廓，并注明色层的名称和颜色。2.观察荧光现象的实验中，在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色，说明颜色有何不同并解释原因。3.皂化反应中，说明上下各层液所含色素种类。4.叶绿体色素提取液中分别加入5%HCl和醋酸铜粉末，观察溶液颜色变化，并解释原因。