实验三蛋白质及氨基酸的显色反应一、目的和要求1、学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。2、进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成单位。二、试剂和器材试剂1.蛋白质溶液：取5mL蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。2.0.1%茚三酮乙醇溶液3.尿素粉末4.1%硫酸铜溶液5.10%氢氧化钠溶液6.0.5%苯酚溶液7.浓硝酸8.0.5%甘氨酸9.0.3%酪氨酸10.头发11.指甲屑器材1.试管及试管架2.水浴锅3.酒精灯4.移液枪5.滤纸片6.烘箱Ⅰ、双缩脲反应(Biureareaction)原理:双缩脲反应:在碱性条件下，双缩脲与二价铜离子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。操作步骤一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜色。添加硫酸铜勿过量，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。二、取另一支试管，加1mL卵清蛋白溶液和10%NaOH溶液2mL，摇匀，再加1%CuSO４溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。试管壁有白色沉淀时停止加热，冷却形成双缩脲，用试纸试显蓝色加10%氢氧化钠溶液约1ml再加1%硫酸铜溶液2滴观察出现的颜色（粉红）再振荡尿素结晶约1g加热酒精灯摇匀使氨放尽双缩脲反应注：1、摇匀；2、硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察；3、需先加NaOH，再加CuSO4，否则将产生蓝色的Cu(OH)2加10%氢氧化钠溶液约1ml再加1%硫酸铜溶液2滴观察出现的颜色（紫玫瑰色）再振荡蛋白质溶液10滴摇匀观察出现的颜色（紫玫瑰色带蓝）5滴1%硫酸铜加1%硫酸铜溶液2滴再加10%氢氧化钠溶液约1ml观察出现的颜色（较深的蓝紫色）再振荡蛋白质溶液10滴摇匀观察出现的颜色（紫玫瑰色带蓝）5滴1%硫酸铜产生Cu(OH)2管号12材料尿素鸡蛋清液量少量,加热硬化1ml10%NaOH1ml，振荡混匀21%CuSO４（滴）12现象变化双缩脲反应Ⅱ、茚三酮反应(Ninhydrinreaction)原理:除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生CO２、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成的还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。脯氨酸：黄色此反应的适宜pH为5-7。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，是一种常用的氨基酸定量方法。操作步骤一、取2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热1-2min，观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。Ⅲ、黄色反应(Xanthoproteicreaction)原理凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。操作步骤:一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10%NaOH溶液，观察颜色转变为橙色。二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴，由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色，冷却，逐滴加入10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄色。三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸，观察颜色变化。管号1234材料0.5％苯酚鸡蛋清液指甲头发量（滴)44少许少许