实验四
叶绿素a和叶绿素b的含量的测定
一、实验目的
熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。二、实验原理在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert-Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1(1)OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2(2)Ca为组分a的浓度（g/L）Cb为组分b的浓度（g/L）OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD值。ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表：将表中数值代入上式（1），（2）并整理的：Ca=0.0127OD663-0.00269OD645Cb=0.0229OD645-0.00468OD663若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为：Ca=12.7OD663-2.69OD645(3)Cb=22.9OD645-4.68OD663(4)Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645(5)Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（g/L）。三、仪器、材料和试剂（一）实验仪器高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管（二）实验试剂丙酮，碳酸钙（三）实验材料植物叶片四、实验步骤色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20mL。2.测定光密度：取上述色素提取液1mL，加80%丙酮4mL稀释和转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。3.按公式分别计算色素提取液中叶绿素a，b及叶绿素总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。