(4)另准备4—5个平皿，每皿内均充有胚胎培养基400?l并覆盖有厚8mm硅烷油或液体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO2中置37℃1小时做平衡处理。覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变；第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5?l新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg／1ml分离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开；(6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用；(7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)，此时的卵己可用作DNA注射之用。第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日4.DNA显微注射1）制备持卵管与注射针持卵管制备：在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约5~10cm长的一段，其口径约80~120?m，用玻璃刀将其在离颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形状，口径约15?m。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度。注射针的制备：由拉针器制成，针的口径应低于1?m。第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡（厚约5mm）；（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；2DNA注射第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA装入注射管中；第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养液，仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；注射细胞数量越多越好；第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；（10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日5.体内接种（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)；最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；第39页，共78页，星期日，2025年，2月5日（3）麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；（4）剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒；（5）使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；（6）轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入输卵管内；第40页，共78页，星期日，2025年，2月5日（7）把输卵管及周围组织送回腹腔内；（8）仔细紧密缝合创口，（9）再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。第41页，共78页，星期日，2025年，2月5日第42页，共78页，星期日，2025年，2月5日6.显微注射法获得转基因鼠的成活率第43页，共78页，星期日，2025年，2月5日优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：整