实验五PCR产品纯化及克隆一、实验目的学习PCR产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作技术中最常用的T-A克隆方法。第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的DNA连接酶的连接反应;实验中可采用苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化DNA产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀DNA。利用普通的TaqDNA聚合酶所扩增的PCR产物的3’-端具有一个A突出末端，T载体的5’-端具有一个T突出末端，二者正好互补，然后用T4DNA连接酶在体外将目的片段与线性化载体连接的方法称为T-A克隆。第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日三、实验材料实验四的PCR产品pMD19-TVector四、试剂TE缓冲液苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、70%乙醇T4DNA连接酶混合物(SolutionI)第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日实验要求两人一组，独立实验每次实验完成均要求写实验报告及思考题不得旷课，特殊情况可补实验每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶本课程考核前6个实验共计50分（实验报告和思考题）（本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩）综合实验（包括设计报告）共计50分第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日实验一质粒DNA的制备与质量鉴定一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日三、实验材料与主要试剂实验材料：含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α主要试剂：溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L溶液II：0.2mol/LNaOH溶液（内含1%SDS）,现配现用溶液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O；饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，含RNA酶（RNaseA）:20μg/ml醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日四、实验步骤1)吸取1.4ml菌液至1.5ml离心管中。2)离心(8000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。3)加入150μL溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200μL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心(14000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450~500μL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠