利用选择性吸附的纯化方法1．羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。2．疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日（八）利用对配体的特异生物学
亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日六、蛋白质含量测定和纯度鉴定第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克一、蛋白质分子的大小第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日第1页，共49页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。一、蛋白质的两性电离及等电点第2页，共49页，星期日，2025年，2月5日蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白质的两性电离及等电点第3页，共49页，星期日，2025年，2月5日二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液第4页，共49页，星期日，2025年，2月5日蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质第5页，共49页，星期日，2025年，2月5日（二）蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等第6页，共49页，星期日，2025年，2月5日不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ第7页，共49页，星期日，2025年，2月5日1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性第8页，共49页，星期日，2025年，2月5日等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶第9页，共49页，星期日，2025年，2月5日盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）第10页，共49页，星期日，2025年，2月5日2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀第11页，共49页，星期日，2025年，2月5日4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态第12页，共49页，星期日，2025年，2月5日一.?分离纯化蛋白质的意义1.研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性；2.提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态；3.作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。二、蛋白质提纯的总目标：增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。三、蛋白质分离纯化的一般原则第13页，共49页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方