（2）菌种复壮方法纯种分离：通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。第126页，共147页，星期日，2025年，2月5日通过宿主体内生长进行复壮。对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。淘汰已衰退的个体，如低温抗性筛选。第127页，共147页，星期日，2025年，2月5日第三节工业微生物种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要第128页，共147页，星期日，2025年，2月5日种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、种子扩大培养的目的与要求1、种子扩大培养的概念:第129页，共147页，星期日，2025年，2月5日2、种子扩大培养的方法:液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有关。表面培养法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。固体培养法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。第130页，共147页，星期日，2025年，2月5日3、种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平第131页，共147页，星期日，2025年，2月5日4、种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，能保持稳定的生产性能活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染第132页，共147页，星期日，2025年，2月5日二、种子制备的技术概要1、种子制备的过程沙土管孢子冷冻干燥孢子斜面孢子培养摇瓶液体培养茄子瓶斜面培养固体培养基培养一级种子罐培养二级种子罐培养三级种子罐培养发酵罐（1）种子制备的工艺流程第133页，共147页，星期日，2025年，2月5日第134页，共147页，星期日，2025年，2月5日将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。（4℃菌种不能休眠，仅是抑制微生物的生命活动）1、斜面保藏法第94页，共147页，星期日，2025年，2月5日2、穿刺保藏法将含0.6-0.8%的琼脂培养基装试管灭菌，直立冷凝后，用接种针尖挑去少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待培养好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。缺点：易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。贵重菌株及优良菌株不易用此法。第95页，共147页，星期日，2025年，2月5日原理：将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，使菌种与空气隔绝，菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还可防止水分蒸发，在低温下达到较长期保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4℃-4℃，适用于不产孢子的菌种。方法：斜面菌种，纯净优质石蜡油置三角瓶121℃灭菌1-2h，放入烘箱中（160℃）干热处理，待石蜡油清澈透明后加入斜面，其用量以高出斜面顶端1CM为准。将试管直立，置低温下保存。特点：此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。3、液体石蜡保藏法第96页，共147页，星期日，2025年，2月5日以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。第97页，共147页，星期日，2025年，2月5日（二）冷冻保藏法冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)液氮冷冻保藏技术第98页，共147页，星期日，2025年，2月5日1、普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培