*****************Taqman原理：除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而受光刺激激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。************Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。****StandardCurve(标准曲线)：CT/TC/CP与起始模板量的对数呈反比关系：Y=-aX+b其中X=LogConcentrationY=CT/TC/CPPCR扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的CT/TC/CP值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。****定量PCR（quantitativePCR）用PCR方法定量主要有两种：终点定量（endpointPCR）在PCR循环结束后对PCR扩增产物进行测定量化，而PCR到达平台期时检测重现性差，无法准确定量。对数期定量（LogphasePCR）在PCR的对数增长期对PCR扩增产物进行测定量化，最大定量范围可达到10个数量级，如荧光定量PCR。***********************************内标工作原理图第30页，共55页，星期日，2025年，2月5日荧光PCR
在临床诊断上的应用第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR的临床应用早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证输血源的筛选母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日HBVDNA与血清免疫学的关系HBVDNA与HBsAg/HBsAb的关系
HBsAg（+）HBVDNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。
HBsAg（-）HBVDNA（+）：“窗口期”；HBsAg的水平过低无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBVDNA阳性；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%，
HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBVDNA同时阳性，但通常HBVDNA检出率逐步下降HBVDNA与HBeAg/HBeAb的关系
HBeAg阳性与HBVDNA有显著相关。HBeAg阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日病毒感染窗口期的NAT检测第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日Lametal-Hepatol26:226,1997对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用