三克隆的技术方法克隆主要是指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术。第30页，共86页，星期日，2025年，2月5日1、细胞核移植细胞核移植是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。细胞核连续移植可以产生无限个遗传相同的个体。细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。第31页，共86页，星期日，2025年，2月5日用紫外光照射受精卵，破坏原来的细胞核；取得另一个细胞的细胞核；再用极细的玻璃针，重新将新的细胞核植入卵中。其中破坏卵细胞核的目的是为了避免当细胞融合后，不会因为存有多余的染色体而影响细胞正常的生长及分裂。细胞核移植技术要点第32页，共86页，星期日，2025年，2月5日
2、克隆动物的一般制备技术
克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。第33页，共86页，星期日，2025年，2月5日胚胎细胞核移植法
将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使这些单个细胞与去除染色体的未受精的卵细胞融合。克隆动物制备的一般过程：核供体动物的选择与细胞核的获得→核受体动物的选择与细胞核的移出→供体核的移入及原核的取出→胚泡的体外试管培养→代母的选择与胚泡移入子宫→克隆动物的体内发育与出生第34页，共86页，星期日，2025年，2月5日
胚胎干细胞核移植
胚胎干（EmbryonicStem,ES）细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织。第35页，共86页，星期日，2025年，2月5日ES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需进行细胞周期的调控。迄今为止，只有在小鼠和人已培养建立ES系，而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞，因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功。第36页，共86页，星期日，2025年，2月5日胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植是指从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，克隆出动物个体。第37页，共86页，星期日，2025年，2月5日体细胞核移植技术
体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。用体细胞克隆出哺乳动物，是由英国科学家维尔穆特开创的。而“多莉”是世界上第一例用体细胞──乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，在复杂的人工操作下，得到的一只小绵羊。第38页，共86页，星期日，2025年，2月5日英国科学家维尔穆特（Wilmut）与多莉（Dolly）第39页，共86页，星期日，2025年，2月5日“多莉”克隆的操作过程：1）?从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；2）?从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；3）?利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；4）将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。第40页，共86页，星期日，2025年，2月5日277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。第41页，共86页，星期日，2025年，2月5日第42页，共86页，星期日，2025年，2月5日多莉羊第43页，共86页，星期日，2025年，2月5日细胞核的移核过程第44页，共86页，星期日，2025年，2月5日克隆技术的科学意义和潜在的经济效益十分巨大。
1、克隆动物实验成功是生物学上一个重大贡献。它证明哺乳动物体细胞也有全能性