NCA的合成：酰氯法、光气法第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日3.8固相合成固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日1.抗原多肽的设计2.抗原多肽的偶联策略3.多肽合成简介4.抗多肽血清的制备5.血清的检测第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日1.抗原多肽的设计为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。（1）什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日（2）选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性(Hydrophilicity)：大部分抗原决定簇是亲水性的；2．表面可接触性(SurfaceAccessibility)：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性(flexibility)：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日（3）抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。（4）抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性、亲水性和弹性进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor,Protean,GCG等。备注第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日（5）设计多肽序列的长度抗原性区域确定以后，接下来要确定多肽的长度。关于选定多肽长度有两种不同的观点。一种观点认为长的多肽（20－40个氨基酸）比较好，因为长的多肽无疑会增加抗原基的数量。另一种观点则认为小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所产生抗体的位点特异性。但有一点是明确的，不管长度如何，所选多肽必须能够较容易地通过生化合成得到，并且能溶解到水溶性缓冲剂进行载体蛋白的耦联。由于受副反应的影响较大，高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高纯度合成，并且常常会含有缺失性序列。第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日另一方面，太短的多肽（10个氨基酸）则会产生识别特异性很强的抗体，以至于无法识别整体蛋白，或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般是10－20个氨基。这种长度的多肽序列会最大程度的减小生化合成困难，具有一定的水溶性，也会具有一定程度的二级结构。（6）设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1．载体蛋白的接入位置。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基团，而N端被掩盖。同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N端位置，使C端完全暴露给免疫系统。3．相反，如果其序列是位于蛋白质N端，此多肽C端应掩盖，暴露出N端，而载体蛋白应在C端。第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日2.抗原多肽的耦联策略化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽耦联的载体蛋白有多种，其中最常用的是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更