电子显微镜的冷冻制样技术*第一节冷冻固定一、冷冻固定及其要素：2、冷冻固定三要素：冷冻速度、温度和细胞质浓度1、概念：在制冷剂的作用下使样品快速冻结、硬化，从而保持样品原有的超微结构和化学成分，改善某些物理性质，便于后续处理或观察。冷冻速度：大于7800℃/秒，形成的冰晶小于20nm。温度：低于再结晶点（-160℃）细胞质的浓度：浓度高则温差小，不易冻伤。*3.冷冻温度：水分结冰时：在-70~-130℃时形成六角形的冰晶在-120~-140℃时形成立方形冰晶细胞损伤当冷冻温度低于-160℃时才能形成无定形冰，冷冻固定时，必须在瞬间将温度降至-160℃，使细胞内外同时被冻结而形成玻璃态的冰，确保细胞生活状态时的形态。组织冷冻损伤的温度与细胞质本身的浓度相关。*4.细胞质的浓度与冷冻保护剂：（1）细胞质的浓度与冷冻温度的关系：冷冻点：当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻点。固、液共存。再结晶点：细胞全部冻结成为固态时的温度。冷冻点再结晶点细胞内开始形成冰晶全部冻结冰晶增大的过程细胞损伤的阶段细胞浓度越高，冷冻点与再结晶电的温差越小。*常用防冻剂的特性渗透性非渗透性甘油二甲基亚乙二醇羟基乙基淀粉葡萄糖保护剂分子量92.1178.1362.074500006850熔点℃2018.5-11.5沸点℃290189198常用防冻剂：甘油、葡萄糖、蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜作用：增大细胞质浓度，缩小冷冻点与再结晶点的温差。纯水冷冻点为0℃，再结晶点为-130℃；植物细胞冷冻点-2℃，再结晶点为-55℃；含糖原多的细胞冷冻点-15℃，再结晶点为-25℃（2）冷冻保护剂：*二、冷冻固定方法：新鲜样品戊二醛固定保护剂处理冷冻固定预冷样品室冷冻干燥或切片（1）液氮直接冷冻法：（2）中间冷媒法：速率高小块样品用一滴保护剂粘在样品头上，迅速投入液氮中冷冻固定。液氮金属杯液氮预冷金属杯杯内注入丙烷样品投入丙烷中冷冻1.冷冻固定的基本流程：2.方法：内含丙烷*二、冷冻干燥方法：第二节冷冻干燥技术一、概念：将新鲜的或经戊二醛固定的样品快速冷冻固定，然后转移到真空容器中并保持低温条件，使样品中的固态水直接升华，而达到脱水干燥的目的。优点：能消除表面张力引起的变形，避免脱水剂对细胞成分的抽提，较好地保存可溶性物质。1.新鲜样品直接冷冻干燥法：鲜样粘在铜片冷冻固定真空干燥器回温常规包埋导电处理TEMSEM预冷却-80℃2.有机溶剂取代的冷冻干燥法：常规固定脱水100%乙醚冷冻真空干燥回温后续处理*第三节冷冻超薄切片技术一、类型直接冷冻固定：橡胶、塑料等弹性材料和高分子材料，生物材料进行X射线微区分析醛固定、冷冻保护：形态研究、细胞化学、免疫化学二、制作流程：取材醛类固定保护处理冷冻固定超薄切片染色镜检五字原则pH值/渗透压温度/时间持续-140℃回温后进行*第四节冷冻断裂复型技术一、冷冻断裂复型技术及其特点：1.冷冻断裂复型技术：新鲜样品通过冷冻断裂，将断面制成可以反映样品形态的复型膜，以便在透射电镜下观察的制样技术。2.特点：避免化学处理损伤，能更好地保存细胞生活状态；能显示细胞劈裂面的超微结构，分辨率较高；图像立体感强；由铂,碳制成的复型膜，耐受电子束轰击，易于长期保存；操作简单，样品制备周期短（与超薄切片比较）3.应用：研究生物体细胞的膜结构以及非生物类物质结构。又叫冷冻蚀刻技术*1.超薄切片的核膜2.断裂复型的核膜冷冻断裂复型样品的图像特点*图示流程预处理/冷冻固定样品断裂/暴露观察面离子蚀刻/表面冰升华喷镀复型膜/碳、铂金分离复型膜/网捞二、冷冻断裂复型的方法*三、冷冻断裂复型膜的