细胞悬浮培养起始培养物的建立选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高浓度激素；必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日建立细胞悬浮系第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日悬浮培养细胞数目的增殖变化第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和继代时原种细胞所处的生长期有关；
对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变
直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期
缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少；
静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日影响悬浮细胞生长的因素：?起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。?接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。?培养条件：方式、温度、继代周期第37页，共60页，星期日，2025年，2月5日植物细胞悬浮培养的生物反应器—自学生物反应器是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。机械搅拌式培养系统气升式反应器鼓泡式反应器第38页，共60页，星期日，2025年，2月5日植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基，可分为成批培养、连续培养、半连续培养方式等。成批培养（batchculture）:指在一个培养体积中，接种细胞和添加培养基后，中途不添加培养基也不更换培养基的方式。植物细胞规模化培养方式第39页，共60页，星期日，2025年，2月5日连续培养（continuousculture）:在培养过程中，不断地向反应器中添加培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养液，从而维持培养系统的内在细胞密度、产物浓度以及物理状态相对平衡的培养方式。半连续培养（semi-continuousculture）:这是一种介于成批培养与连续培养之间的培养方式，其基本方法是在完成上述成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一个培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。第40页，共60页，星期日，2025年，2月5日?植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。1、海藻酸盐固定化在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和Ca2+之间以离子键形成不溶于水的海藻酸钙，从而在细胞表面形成凝胶。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。无菌空气入口玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液 空气出口形成胶体颗粒的喷射口 隔滤板装有CaCl2溶液的烧瓶植物细胞固定化方法海藻酸盐固定化细胞步骤第41页，共60页，星期日，2025年，2月5日 ?常用方法：（1）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含NaCl的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中KCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2）模铸法：将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。（3）两相法：将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。2、卡拉胶固定化第42页，共60页，星期日，2025年，2月5日 ?琼脂糖(Agarose)固定化：（1）凝块法：将细胞悬浮于