（2）酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。■DNA复制起始区a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b：酵母菌的天然2μ质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。第30页，共46页，星期日，2025年，2月5日■选择标记基因a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b：显性选择标记（G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。■有丝分裂稳定区来源于酵母染色体着丝粒（centromere）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。■表达盒表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。启动子：保证转录的起始。分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日多克隆位点：供外源基因插入。终止子：保证转录在适当位置停止。（3）酵母基因表达载体的种类■自主复制型质粒载体该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。酵母基因组DNA复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322。这类载体的优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达200个缺点在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。■整合型质粒载体该质粒载体不含有酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。■着丝粒型质粒载体该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。■酵母人工染色体第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日第1页，共46页，星期日，2025年，2月5日第一节外源基因在原核细胞中的表达1.原核生物基因表达的特点与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。（4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对第2页，共46页，星期日，2025年，2月5日基因产物的直接控制要慢。（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。2.原核表达系统的注意事项从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。（2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合成第3页，共46页，星期日，2025年，2月5日的基因，而不能用基因组DNA。（3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基的表达。（4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。（5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。3.原核生物基因表达的调控序列只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序第4页，共46页，星期日，2025年，2月5日列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（1）启动子启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是