BRAFV600基因突变检测试剂盒(PCR荧光法)说明书
【产品名称】
通用名称：BRAFV600基因突变检测试剂盒(PCR荧光法)
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英文名称：cobas4800BRAFV600MutationTest
【包装规格】
24测试
【预期用途】
用途
本产品用于体外定性检测福尔马林固定、石蜡包埋的人类黑色素瘤组织样本和乳头状甲状腺
癌组织样本的DNA提取物中的BRAFV600E突变。在黑色素瘤中，该检测适合作为辅助手段
帮助筛选BRAFV600突变的患者用于佐博伏(维莫非尼)单药治疗。
测试概要与说明
在许多人类肿瘤中存在原癌基因BRAF活化突变，包括恶性黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌以及
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甲状腺肿瘤。研究表明，在40-60%的恶性黑色素瘤和36-46%的乳头状甲状腺癌中存在
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BRAF的突变。在某些良性的痣中亦常见BRAF突变，这表明在肿瘤发生中，这类突变是较
早发生的事件。在黑色素瘤、乳头状甲状腺癌以及其他人类肿瘤中发现BRAF基因存在的这
类体细胞突变有助于阐明BRAF激酶在控制细胞增殖、分化和死亡信号通路中的重要作用。
在正常细胞中，BRAF是高度调控信号通路中的一个分子，其介导通过RAS、RAF、MEK以
及ERK信号通路由生长因子受体(如EGFR受体)所引起的效应。BRAF中原癌基因的突变导致
其获得激酶功能，使RAF-MEK-ERK通路在无典型生长因子存在的条件下亦持续活化。
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在黑色素瘤、乳头状甲状腺癌以及人类肿瘤中，BRAF的主要突变发生于密码子600。在密码
子600最主要的突变是V600E的突变(GTGGAG)。一些影响密码子600的双核苷酸突变
(V600K,[(GTGAAG),V600R(GTGAGG)V600E2(GTGGAA)以及V600D(GTG
GAT)])较少见，主要见于黑色素瘤，较少见于其他肿瘤，如直结肠癌。BRAFV600基因突
变检测试剂盒(PCR荧光法)是一种用于检测V600E(T1799A)突变的实时荧光PCR试剂。
cobas?BRAFV600基因突变检测试剂盒用于维莫非尼的伴随诊断，维莫非尼是一种治疗
BRAFV600E突变的黑色素瘤患者的药物，有临床研究显示有BRAFV600E突变的晚期黑色素
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瘤患者可以从维莫非尼中获益。BRAFV600突变黑色素瘤样本中大概有10-15%的样本具有
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V600E的突变。
【检验原理】
方法原理
BRAFV600基因突变检测试剂盒(PCR荧光法)基于两个主要过程：[1]手工法从FFPET样本中
制备基因组DNA；以及[2]应用互补引物和两个荧光素标记寡核苷酸探针对靶DNA序列进行
扩增与检测。一个探针用于检测野生型BRAFV600序列，另一个探针用于检测V600E突变序
列。在试剂盒中提供两个外源性运行质控以及作为内参的野生型位点，对全过程进行质量控
制。
野生型BRAF第600密码子会被作为BRAF检测的内部质控(IC)，通过野生型探针在通道2中产
生信号。
样本制备
处理FFPET样本并应用基于核酸结合玻璃纤维原理的(一种常用的手工制备核酸样本的原
理)DNA样品制备试剂盒提取基因组DNA。将5μm厚的FFPET样本切片脱蜡，与蛋白酶以及
chaotropic裂解液/结合缓冲液共同在高温下孵育以裂解样本并释放核酸，反应所用缓冲液可
保护核酸免受DNAse降解。随后，向裂解混合溶液中加入异丙醇并通过一个含有玻璃纤维滤
膜内芯的过滤柱离心。在离心过程中，基因组DNA与玻璃纤维滤膜结合。通过离心可去除未
结合成分，如盐类、蛋白质以及其他细胞杂质。用水溶液洗脱结合的核酸。通过分光光度计
测定获得基因组DNA含量并调整至固定浓度加入扩增/检测混合物中。随后，应用BRAF
V600突变检测试剂盒提供的扩增和检测试剂在cobasz480分析仪上进行靶DNA的扩增与检