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团体标准
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监测病毒载体稳定携带治疗基因的分析质控技术标准
Technicalspecificationsforqualitycontrolanalysisofstableviralvectorcarryingtherapeuticgenes
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FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布
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深圳市深圳标准促进会???发布
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监测病毒载体稳定携带治疗基因的分析质控技术规范
范围
本文件规定了使用监测辛德毕斯病毒载体稳定携带治疗基因的分析方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品、实验步骤、结果分析。
本文件适用于监测辛德毕斯病毒载体携带治疗基因稳定性的测定。
规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
辛德毕斯病毒sindbisvirus（SINV）
属于属披膜病毒科甲病毒属，基因组为单链RNA。
增强型绿色荧光蛋白基因enhancedgreenfluorescentproteingene（EGFP）
一种能够表达绿色荧光蛋白的基因，所表达的蛋白能够在激发波长为488nm，可产生507nm的激发峰。
原理
病毒是一种自然界长期进化的微生物，其基因组具有良好的稳定性。当病毒作为载体递送外源基因进入细胞的过程中，由于外源基因插入病毒基因组后，存在病毒会将插入的外源基因从基因组中删除的情况。为此，监测病毒载体是否稳定携带治疗基因具有十分重要的作用。
试剂和材料
试剂
引物
引物有以下两种：
F:TGCAGCATGATGCTGACTAG；
R:TAGGATCCATGGTCTAGAGT。
试剂盒
试剂盒有以下两种：
病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit（QIAGEN，52906）；
一步法高效RT-PCR试剂盒HiScriptIIOneStepRT-PCRKit（Vazyme，P612）。
其他细胞和病毒培养所需试剂
主要有以下其他细胞和病毒培养所需试剂：
DMEM高糖培养基；
胎牛血清；
青霉素-链霉素溶液；
胰酶溶液；
核酸marker；
TAE缓冲液等。
材料
主要有以下材料：
细胞培养板；
1.5mL离心管（RNaseandDNasefree）；
200uLPCR管（RNaseandDNasefree）；
移液器吸头；
0.22?m滤膜。
仪器和设备
主要有以下仪器和设备：
CO2细胞培养箱；
生物安全柜；
显微镜；
台式离心机；
紫外-可见分光光度计；
PCR仪；
琼脂糖凝胶电泳仪；
凝胶成像仪。
样品
样品有SINV-WT-EGFP病毒（P0代）和SINV-G285S-EGFP病毒（P0代）。
试验步骤
按照以下步骤进行试验：
提前一天在6孔板中以每孔8×105的密度接种BHK-21细胞；
将SINV-WT-EGFP和SINV-G285S-EGFP的P0代病毒以0.1MOI分别感染新鲜的BHK-21细胞；
感染后48小时收集病毒上清，收集的病毒上清为P1代病毒。将病毒上清进行离心（5000xg，5min），过滤(0.22?m滤膜)后，分装冻存在-80℃冰箱中，避免反复冻融；
重复步骤a）；
将SINV-WT-EGFP和SINV-G285S-EGFP的P1代病毒以0.1MOI分别感染新鲜的BHK-21细胞；
感染后48小时收集病毒上清，收集的病毒上清为P2代病毒。将病毒上清离心（5000xg，5min），过滤(0.22?m滤膜)后，分装冻存在-80℃冰箱中，避免反复冻融；
按照步骤e）和f）的方法，将SINV-WT-EGFP和SINV-G285S-EGFP进行连续传代，收集每一代的病毒上清；
将收集的病毒上清取140uL，使用病毒RNA提取试剂盒（QIAampViralRNAMiniKit）进行每代病毒RNA的提取，并用Nanodrop2000C进行RNA浓度的测定；
在RNase-free的200uLPCR管中按照表1配制混合液。
混合液配置比例表
序号
内容物
剂量
1
RNase-freeddH2O
To