测序以及序列分析专栏
Sanger测序
人类基因组计划使用的测序方法是sanger测序，它的原理是在DNA
合成过程中，DNA聚合酶能够使用ddNTP(双脱氧核苷酸）来作为原料，
但它的反应会在加入ddNTP的时候终止，最后产生了一系列长度不一
并且分别在以A,G,C,T时终止的DNA片段。接着我们拿着这些片段去
进行一个高分辨率的电泳（能够区分出一个碱基的差别)，然后根据
电泳结果，我们就能读出序列了。
二代测序（以illumina平台为例）
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三代测序（以纳米孔测序为例）
三代测序的核心思想是单分子测序，在不打断DNA的情况下直接把完
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整的序列读出来。
首先人们人工合成了一种蛋白质复合体，把复合体固定到一个电阻率
很高的薄膜上，类似于跨膜的离子通道，但这个通道是用来通过一条
DNA链的。测序的时候给反应体系加上电压，DNA链就可以通过这个
纳米孔，整个测序的反应原理跟其他两者测序方法是一样的，都是PCR
反应。只不过在三代测序中，每加入一个碱基，由于碱基的电荷大小
不一样，通过通道时产生的微电流扰动也不一样。通过记录每一次DNA
链经过通道时产生的电信号，就可以还原出DNA序列的本来面目。
利用序列构建系统发育树
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现代分子生物学一般用保守的基因比对去构建系统发育树，相比于性
状的突变，基因的突变包含的差异信息更多且不易丢失，更能精确的
还原演化历程。
在一段序列中的某个位点，它从A突变成CGT或者保持不变的概率是
多少，这些突变在时间尺度上多久发生一次，都由数学家，生物统计
学家做出了总结。他们提出了分子钟模型，用来解释基因位点发生突
变的速率。
根据这些数学模型，我们可以利用序列的不同去反推这些基因在什么
时候积累了足够多的突变导致物种的分化。
转录组学与RNAseq技术
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我们给整个细胞的DNA测序得到的数据叫做基因组。那给整个细胞的
RNA测序得到的就叫转录组。
基因的表达是受到严格的时间，空间上的调控的。我们如果想研究一
个疾病的发生过程，一个胚胎的发育过程，或者一个器官的再生过程，
那最直接的方法就是比对这些事件发生前后都有哪些基因的表达发
生了改变。
RNAseq,首先需要提取出组织样本里面的RNA，因为mRNA它有一个特
殊的polyA尾巴的结构，所以我们就可以通过针对PolyA尾巴设计的
引物，对mRNA进行富集，再逆转录的方式合成cDNA文库，最后把
cDNA文库送去测序。
测序的结果会用生物信息学的工具比对到基因组上去，看看这些转录
本都属于哪些基因，定量之后，我们就可以看到这些不同的基因的表
达量的变化了。
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一般来说，RNAseq数据给我们的第一个比较重要的结果就是差异表
达分析，你可以输出这样的几个图，图一是韦恩图，展示了两个组之
间有多少基因是下调或上调的，图B是散点图，每个点都代表了一个
基因相对于对照组的表达情况，你可以把它变成旁边的火山图横轴是
Foldchange取了以2为底数的对数，大于0的点是上调的，而小于0
的点是下调的。但是这些点的置信度都不一样，置信度我们这里用到
是q值，y轴是给q值取了以10为底的对数。一般来说，我们的
log2FC绝对值大于1，q值小于0.05.
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做完差异表达，一般下一步会做的是通路富集。通路富集就是把我们
的测序结果比对到公共数据库上去，看一看我们富集到的有差异的基
因主要集中在哪些信号通路，细胞活动，或者代谢过程上。比较常用
的有俩个数据库，一个叫KEGG，另一个叫Geneontology,简称GO。
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