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T/HEBQIAXXXX—2025
农杆菌介导棉花遗传转化技术规程
1范围
本文件规定了农杆菌介导棉花遗传转化技术的原理、设备和用具、试剂、培养基、无菌苗培养、侵染液制备、遗传转化、生根培养、炼苗移栽、目的基因检测。
本文件适用于农杆菌介导棉花遗传转化的操作过程。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
农杆菌介导agrobacteriummediation
利用土壤中普遍存在的革兰氏阴性细菌-农杆菌，来实现外源基因向植物细胞的转移和整合的转基因技术。
3.2
遗传转化genetictransformation
同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。
4原理
农杆菌介导法是通过诱导农杆菌侵染过的下胚轴产生转化的愈伤组织，再将转化的愈伤组织进行扩增，进一步诱导产生胚性愈伤并诱导植株再生。以棉花幼苗下胚轴为受体材料，利用农杆菌中Ti质粒或Ri质粒上的T-DNA可被转移并整合到棉花基因组的特性，通过棉花下胚轴受伤后释放的信号分子激活农杆菌的Vir基因，促使T-DNA携带目的基因进入棉花细胞并整合到基因组中，使棉花获得新性状。
5设备和用具
5.1仪器
电子天平（精度0.0001g、0.01mg）、超净工作台、培养箱、细菌培养箱、超低温冰箱（-80℃)。
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5.2用具
剪刀、手术刀、镊子、无菌滤纸、培养瓶、离心管、培养皿、营养钵。
6试剂
6.1除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或无菌水。所有试剂溶液宜大体积
（1L）配制、小体积（10mL）分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂通过0.22μm滤膜过滤除菌。
6.2试剂：硝酸钾、硫酸镁或七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、无水氯化钙或二水合氯化钙、硼酸、四水
硫酸锰或一水硫酸锰、七水硫酸锌、六水合氯化钴、五水硫酸铜、碘化钾、二水合钼酸钠、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、甘氨酸、肌醇、葡萄糖、植物凝胶、2，4-D、
激动素、硝酸铵、六水合氯化镁、硫酸卡那霉素、头孢类抗生素、吲哚丁酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、牛肉浸膏、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、利福平、胰蛋白胨、甘露醇。
7培养基
7.1MS培养基
MS培养基成分见表1，加蒸馏水定容至1L，调节pH=5.85～5.90。
表1MS培养基成分
成分
化合物
母液浓度/（g/L）
贮备液倍数
大量元素母液
硝酸钾
38
20
硫酸镁/七水合硫酸镁
3.8/7.4
磷酸二氢钾
3.40
无水氯化钙/二水合氯化钙
6.6/8.8
微量元素母液
5倍母液Ⅰ
硼酸
3.1
1000
四水硫酸锰/一水硫酸锰
11.50/8.45
七水硫酸锌
4.3
20倍母液Ⅱ
六水合氯化钴
0.050
五水硫酸铜
0.050
碘化钾
1.66
二水合钼酸钠
0.50
铁盐母液
硫酸亚铁
2.78
100
乙二胺四乙酸二钠
3.73
B5有机物
盐酸硫胺素
1.0
100
盐酸吡哆醇
0.1
烟酸
0.1
甘氨酸
2.0
肌醇
10.0
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7.2无菌苗培养基
成分：1/2大量元素、15g葡萄糖、2.6g植物凝胶，加蒸馏水定容至1L，调节pH=6.00～6.10。
7.3共培养培养基
成分：MS培养基、0.1mg2，4-D、0.1mg激动素、1.65g硝酸铵、1.0g六水合氯化镁、30g葡萄糖、2.6g植物凝胶，加蒸馏水定容至1L，调节pH=5.85～5.95。
7.4愈伤组织诱导培养基
成分：MS培养基、0.1mg2，4-D、0.1mg激动素、1.65g硝酸铵、1.0g六水合氯化镁、30g葡萄糖、2.6g植物凝胶，加蒸馏水定容至1L，调节pH=5.85～5.95。灭菌后加50mg硫酸卡那霉素、400mg头孢类抗生素。
7.5愈伤组织分化培养基
成分：MS培养基、0.5mg吲哚丁酸、0.15mg激动素、1.9g硝酸钾、1.0g谷氨酰胺、0.5g天冬酰胺、30g葡萄糖、2.6g植物凝胶，加蒸馏水定容至1L，调节pH=5.90～5.95。
7.6生根培养基
成分：1/2M