2、酵母杂交一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。第126页，共189页，星期日，2025年，2月5日第八节原生质体育种原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。第127页，共189页，星期日，2025年，2月5日一、原生质体融合育种的特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。第128页，共189页，星期日，2025年，2月5日(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。(六)提高菌株产量的潜力较大。(七)有助于建立工业微生物转化体系。第129页，共189页，星期日，2025年，2月5日二、原生质体融合育种步骤1．标记菌株的筛选和稳定性验证。2．原生质体制备。3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4．涂布于再生培养基，再生出菌落。5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6．生产性能筛选。第130页，共189页，星期日，2025年，2月5日三、原生质体融合育种的要点（一）标记菌种的选择获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。第131页，共189页，星期日，2025年，2月5日(二)原生质体的制备原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。第132页，共189页，星期日，2025年，2月5日影响原生质体制备的因素1．菌体的前处理为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2．菌体的培养时间为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。3．酶浓度对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。第133页，共189页，星期日，2025年，2月5日(二)操作步骤：质粒DNA转化感受态大肠杆菌1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml肉汤培养基中，37℃培养过夜。2．取0.5ml培养物接入50ml肉汤中，无菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振荡培养。3．将o.1mol／LCaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。第94页，共189页，星期日，2025年，2月5日4．当培养物OD600在o.5～o.8左右时，开始收获细胞(大约需2～2.5h)．5．将培养物置冰浴中冷却10min。6．取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。第95页，共189页，星期日，2025年，2月5日7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min离心10min，弃去上清液．9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待转化质粒DNA溶液。第96页，共189页，星期日，2025年，2月5日11．在冰上放置20min，在37℃处理2min。再插入冰中．加入0.9m1肉汤37℃静置培养90min。12．以不同的量涂布选择培养基平板。13．于37℃培养过夜。鉴定转化菌落。第97页，共189页，星期日，2025年，2月5日常用的遗传转化系统1、自然系统2、人工诱导（完整细胞）（1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++辅助噬菌体，Tris+Ca2+（2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）冻融系统（4）Triton处理：人工诱导