蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。信号肽的切割：前导肽Lys-Arg重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶第126页，共186页，星期日，2025年，2月5日6.其它酵母表达系统（1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！①嗜甲烷酵母（Pichiapastoris）的特点第127页，共186页，星期日，2025年，2月5日HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。②表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇产量：9×106剂疫苗/240L发酵罐第128页，共186页，星期日，2025年，2月5日整合到染色体中第129页，共186页，星期日，2025年，2月5日（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料添加剂促进反刍动物消化。产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。第130页，共186页，星期日，2025年，2月5日二、昆虫培养细胞表达系统1.杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：两种形式①单独病毒粒子形式病毒粒子宿主细胞病毒粒子侵染释放第131页，共186页，星期日，2025年，2月5日3.pTYB系列的特点单柱一步纯化蛋白。无需蛋白酶作用即可将目的蛋白与融合蛋白IPTG诱导的T7启动子分离纯化出天然蛋白，不带有载体蛋白残基。第94页，共186页，星期日，2025年，2月5日九、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1.形成正确的二硫键第95页，共186页，星期日，2025年，2月5日人胰岛素分子第96页，共186页，星期日，2025年，2月5日抗体分子人血红蛋白分子第97页，共186页，星期日，2025年，2月5日如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。2.前体切割第98页，共186页，星期日，2025年，2月5日（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3.蛋白质糖基化糖基第99页，共186页，星期日，2025年，2月5日（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第100页，共186页，星期日，2025年，2月5日磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化4.氨基酸残基的修饰羟脯氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸第101页，共186页，星期日，2025年，2月5日缺乏蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸修饰等）。十、原核细胞表达的缺陷第102页，共186页，星期日，2025年，2月5日酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因第103页，共186页，星期日，2025年，2月5日真核细胞表达体系表达外源具有以下特点：真核细胞可识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽;真核细胞内具有一系列剪切酶2.真核基因在真核细胞中表达时，其S-D序列与细胞核糖体RNA（rRNA）16S亚基3’末端的互补程度较高，对翻译水平的调节有利;第104页，共186页，星期日，2025年，2月5日3.在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性;4.外源基因导入真核细胞的效率较低，其在染色体DNA上的整合是随机的和自发的，无法控制整合的位置和拷贝数;5.真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高.第105页，共186页，星期日，2025年，2月5日①能在E.coli中克隆和扩增。1.酵母克隆载体一、在酵母中表达Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合适的克隆位点。③有酵母的选择标记Ori②有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。第106页，共186页，星期日，2025年，2月5日DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells第107页，共186页，星期日，2025年，2月5日由大肠杆菌质粒和