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组织提取胶原细胞迁移实验操作指南
1范围
本文件规定了动物组织提取胶原蛋白细胞迁移实验的术语和定义、实验原理、试验试剂、耗材与设备、供试液和对照组样品的制备、细胞制备、实验步骤、结果判定与试验报告等内容。
本标准适用于评估可溶或者部分可溶的组织提取胶原蛋白促进细胞迁移的能力。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
YY/T1955-2025组织工程医疗器械产品胶原蛋白术语
3术语和定义
YY/T1955-2025界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
组织提取胶原蛋白
指以动物组织，如皮肤、骨骼、软骨等为来源，运用酶解法、酸法、盐析法等物理化学工艺进行提取，并经特定处理后，得到的具有典型三螺旋结构、呈现纤维状的大分子蛋白质。
3.2
细胞划痕试验
又称伤口愈合实验，是一种在体外评估细胞迁移能力的实验方法。
4实验原理
在体外培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长汇合的区域进行划线操作，人为制造一个无细胞的空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过测量细胞在一定时间内（如24h、48h）从划痕边缘向划痕中心迁移的面积，与初始划痕面积进行比较，以此计算细胞的迁移的程度。试验通常需设定对照组和供试组,对照组包括阳性对照组和空白对照组，通过对比不同组之间细胞迁移的程度，以此评价受试物促进细胞迁移的能力。
5试验试剂、耗材与设备
5.1试验设备
二氧化碳培养箱、移液器、生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴锅、离心机、移液器、冰箱。
5.2试验耗材
细胞培养瓶、24孔细胞培养板（贴壁型）、枪头、钢尺、冻存管、离心管、试剂瓶、0.22μm无菌滤膜。
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5.3试验试剂
冰醋酸（纯度≥99.5％）、氢氧化钠（分析纯）胎牛血清、纯化水、DMEM高糖（无谷氨酰胺、无钙离子）、胰蛋白酶-EDTA（0.25％）、磷酸盐缓冲液（PBS）、谷氨酰胺、Animal-FreeRecombinantHumanEGF、钙离子吸附树脂、0.1％BSA（细胞培养用）。
5.4试验试剂配制
5.4.10.1mol/L的醋酸溶液：准确量取5.72mL冰醋酸，用纯化水定容至1000mL。
5.4.24mol/L的氢氧化钠溶液：称取4.000g氢氧化钠，加入纯化水溶解并定容至25mL。用0.22μm滤膜过滤，制备成4MNaOH溶液储备液，室温保存。
5.4.3去钙离子血清：称取钙离子吸附树脂Chelex100Resin2.5g至50mL离心管，加入50mLFBS，在2℃~8℃条件下充分振摇约2h，离心或者静置去除吸附剂，取上清FBS，无菌环境下0.22μm滤膜过滤，即得到去除钙离子血清。
5.4.4基础培养基：由99％的DMEM高糖培养基（无谷氨酰胺、无钙离子）与1％的谷氨酰胺溶液混合而成。
5.4.5完全培养基：由99％的DMEM高糖培养基（无谷氨酰胺、无钙离子）与1％的谷氨酰胺溶液，以及10％去钙离子血清混合而成。
5.4.6EGF母液（0.1mg/mL）：开瓶前4℃,4000rpm离心5min，加入适量恢复至常温的0.1%BSA溶液，使终浓度为0.1mg/mL。轻轻混匀溶解EGF粉末。待EGF粉末充分溶解后短暂离心分装并于超低温冰箱保存。
5.4.7EGF储存液（10μg/mL）：将EGF母液（0.1mg/mL）用0.1％BSA溶液进行10倍稀释，轻轻吹打混匀，分装并于超低温冰箱保存。
6供试液和对照组样品的制备
6.1通用要求
供试液制备过程中应避免加热（样品温度不应超过其热变性温度）或冷冻，同时应避免激烈的震荡、搅拌或超声处理，因为加热或剪切力等因素会导致供试液中的胶原蛋白变性，从而影响测试结果的准确性。
供试液一般宜在测试的当天配置，必要时可提前1天配制并在2℃~8℃冰箱储存。
供试液应无菌。
6.2供试液的制备
6.2.1受试物溶解
受试物为可溶性的组织提取胶原蛋白固体时，称取适量受试物，加入0.1mol/L的醋酸溶液，使受试物充分溶解，溶解后的终浓度为1mg/mL～5mg/mL。
受试物为组织提取胶原蛋白凝胶或溶