五、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建2、中间载体/表达载体的构建3、植物基因转化载体系统的构建第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建
野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，基因工程中难以操作；②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，..难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；③T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体；⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（intermediatevector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲载体（disarmedvector）。第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日2、onc-卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的（non-oncogenic）Ti质粒载体。因为利用野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“武装”,构建成所谓“卸甲”或称“缴械”载体（disarmedvector）。在这种onc-载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日onc+卸甲载体?对于研究外源基因在转基因植株中的表达，以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言，onc-体系是最有用的。不过，人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表达问题。在这种情况下，使用onc+菌株载体则比较合适。由于冠瘿瘤组织具有不依赖于激素的表型特征，所以这种载体系统的优点在于它可以快速地增生冠瘿组织，比较快速而容易得到转化体。第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日2、中间载体的构建（1）中间载体的基本结构与特点为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中间载体（intermediatevector）是有效方法之一。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的T-DNA片段，而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于通过体外遗传操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体，即共整合系统中间载体和双元载体系统中间载体。第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日共整合系统中间载体的特征①中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；②它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；③它必须有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；④它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；⑤它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；⑥无Ti质粒的边界序列。第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日双元载体系统的中间载体与共整合系统中间载体不同之处是:①无同源序列；②具有LB和