蛋白质含量测定方法汇总
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实验七??蛋白质含量测定
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测定蛋白质得定量方法有很多,目前常用得有染料法,双缩脲(Ｂiｕret)法,酚试剂法(Lｏwry)法及紫外吸收法。
[目得要求]
1、掌握测定蛋白质得含量基本方法。
２、了解染料法、双缩脲法、Ｌowry法和紫外吸收法测定原理。
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一、染料法
[实验原理]
在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-2５０与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从46０ｎm移至5９5nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典得Lowｒy法趋势,因为她操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法得缺点就就是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异得蛋白质,有一定误差,因为不同得蛋白质与染料得结合就就是不同得,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近得蛋白质。
［器材]
吸量管;试管;721型分光光度计
［试剂]
1、标准牛血清白蛋白溶液:配成0、１mg/ml得溶液。
2、待测蛋白质溶液。
3、染料溶液:称取考马斯亮蓝G-２50?0、1g溶于９５%得酒精50ml,再加入85%得浓磷酸100ｍl,用水稀释至１000mｌ,混匀备用。
［操作步骤］
1、??标准曲线得绘制:
试剂(ml)\管号
0
1
２
３
４
５
标准蛋白溶液
0
0、２
０、4
0、6
０、８
1、0
H２Ｏ
1、０
０、8
0、６
0、4
0、２
0
染料溶液
5、0
5、0
5、０
5、０
5、0
5、0
A595nm
?
?
?
?
?
?
按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
２、样品测定:
取1ml样品溶液(约含2５~250微克蛋白质),加入染料溶液5mｌ混匀,5ｍiｎ后测定其595ｎm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。
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二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
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［实验原理]
在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CＯ-NH-CO-ＮH2)与二价铜离子作用形成紫红色得络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—ＣO－NH2),或与此相似得基团[如—CH2-NＨ2,—ＣS-ＮH2,—C(NH)ＮH２]得任何化合物,无论这类基团直接相连还就就是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1~10ｍg蛋白质。干扰这一测定得物质主要有:硫酸铵、Triｓ缓冲液和某些氨基酸等。
此法得优点就就是较快速,不同得蛋白质产生颜色得深浅相近,以及干扰物质少。主要得缺点就就是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速,但并不需要十分精确得蛋白质测定。
［试剂]
１、双缩脲试剂:取CuSO4·5Ｈ2０(c、Ｐ、)１、5ｇ和酒石酸钾钠(c、Ｐ、)６、0g以少量蒸馏水溶解,再加2、５mｏl/L?NａOH溶液300mｌ,KI?1、０g,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现,即不能使用。
2、标准蛋白质溶液:用标准得结晶牛血清清蛋白(ＢSＡ)或标准酪蛋白,配制成１０g/Ｌ得标准蛋白溶液,可用BSＡ浓度1g/Ｌ得A28０为0、6６来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H２O?或0、9%NaCl配制,酪蛋白用0、05ｍol/L?NaOH配制。
[器材]?
1、试管:1５×150mm?试管7只;?????
2、１ml,5ｍｌ移液管;
3、坐标纸;???????????????????????????
4、７２1分光光度计。
［操作步骤]
?????取试管7支,编号,按下表操作:
试剂(ml)\管号
空白管
1
2
3
4
５
测定管
蛋白标准液(１0ｇ／L)
－
0、1
0、2
0、3
0、4
0、5
-
生理盐水
０、５
0、4
0、3
0、２
０、1
-
0、４
待测样品
－
-
-
-
-
-
0、1
双缩脲试剂
3、0
3、0
3、０
3、0
3、0
3、0
3、0
相当蛋白质(g／L)
0
10
20
30
40
50
?
混匀,3７℃水浴20分钟,冷却至室温,在分光光度计波长5４0nm处,用空白管调零,读取各管吸光度值。1～5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管得吸光度,在标准曲线上求得蛋白质浓度。
[注意事项］
1、双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2+形