动物细胞传代培养传代培养（Passageculture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。注意：每进行一次分离再培养称为传一代。这里的传代代数与细胞代数或倍增不同，“一代”是指从细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在细胞一代中，细胞约能倍增3～6次。悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，或者采用离心或沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。贴壁生长的细胞需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消化法进行传代培养。第29页，共54页，星期日，2025年，2月5日传代培养方法1、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。3、2-5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添加培养液终止消化。4、吸出消化液，加入Hanks液轻轻转动，洗去残留消化液。5、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。6、计数，接种进行传代培养。酶消化法第30页，共54页，星期日，2025年，2月5日动物细胞培养的一般过程动物细胞体外培养一般经过：1、组织获得与消化2、接种3、原代培养4、传代培养第31页，共54页，星期日，2025年，2月5日第32页，共54页，星期日，2025年，2月5日细胞培养过程分析与监测1、细胞形态检查及活力分析：倒置显微镜下观察；四唑盐（MTT）法可以对细胞活力进行分析（活细胞的线粒体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨[jì]并沉淀在细胞中）。2、pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，pH在7.2～7.4之间。CO2的积累使培养液pH下降。当超出缓冲范围时，培养液变黄，需3～4天更换一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染不易被发现。第33页，共54页，星期日，2025年，2月5日细胞系与细胞株1.细胞系(Cellline)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系(Finitecellline)，能连续培养下去的为连续细胞系(Infinitecellline)。2.细胞株(Cellstrain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。第34页，共54页，星期日，2025年，2月5日靶细胞的分离纯化靶细胞的分离纯化方法分为自然纯化和人工纯化。1、自然纯化是多次传代过程中，利用混合系中某一种细胞的增殖优势不断排挤其他类型细胞而最终被纯化的方法。此方法费时费力，选择纯化的细胞具有盲目性。2、人工纯化根据某一类型的细胞生长条件，抑制其他细胞生长，从而达到纯化的目的。（1）细胞因子依赖法：利用靶细胞对特殊细胞因子的需求与其他细胞分离。（2）反复贴壁法：利用不同细胞贴壁速度快慢的差异进行分离。（3）酶消化法：利用不同细胞对消化酶的耐受性差异进行分离。（4）机械法：硅胶软刷刮除非靶细胞。第35页，共54页，星期日，2025年，2月5日细胞株的纯化细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并进行体外繁殖成为新的细胞群体。1、毛细管法：通过无限稀释法将细胞稀释成1个细胞/ml，然后在显微镜下用毛细管将细胞分离出来单独培养形成单克隆细胞群体。2、有限稀释法：将细胞悬液梯度稀释后接种到96孔板，进行一定时间的培养，理论上某一个孔中会有单克隆细胞群体。第36页，共54页，星期日，2025年，2月5日适合工业化生产的细胞株原代细胞传代细胞二倍体细胞异倍体细胞融合细胞转化细胞基因工程细胞有限系细胞无限系细胞永生细胞正常细胞第37页，共54页，星期日，2025年，2月5日转化细胞转化细胞是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由有限性细胞系转化为无限性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。转化细胞方法：1.细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。第38页，共54页，星期日，2025年，2月5日第十一章动物细胞培养生物制药第1页，共54页，星期日，2025年，2月5日动物细胞培养类型动物细胞培养：