4．咪唑基的化学修饰组氨酸残基位于许多酶的活性中心，修饰剂焦碳酸二乙酯DPC对其有较好的专一性，修饰产物在240nm处有最大吸收。常用修饰剂：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPC（均能修饰咪唑环上的两个氮原子）第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日5．胍基的化学修饰精氨酸残基的胍基在中性或弱碱性条件下能与修饰剂发生反应。常用修饰剂：具有两个临位羰基的化合物——丁二酮、苯乙二醛、1，2－环己二酮等。第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日第三章酶蛋白的化学修饰第一节化学修饰的原理第二节化学修饰的方法学第三节酶蛋白侧链基团的修饰第四节酶的亲和修饰第五节酶的化学交联第六节酶化学修饰的应用第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日第一节化学修饰的原理一、酶的化学修饰原因1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．作用的最适条件不符。3．酶的主要动力学性质的不适应。4．临床应用的特殊要求。二、定义酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的。即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被称为修饰试剂。化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日三、酶化学修饰的基本原理1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境影响酶化学修饰反应进程的因素主要有两个：酶蛋白功能基的反应性修饰剂的反应性第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日影响酶化学修饰反应进程的因素：酶蛋白功能基的反应性微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。酶蛋白功能基的超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。但不一定是酶的活性部位基团。第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日影响酶化学修饰反应进程的因素：修饰剂的反应性选择吸附：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低极性区域或高极性区，形成蛋白质－修饰剂复合物。静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白质表面带相反电荷的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度)位阻因素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。(α－溴代酸的大小影响修饰）催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且溶剂效应相当复杂。第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日第二节化学修饰的方法学一、修饰剂的要求二、反应条件的选择三、酶性质的了解四、酶修饰方法第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日一、修饰剂的要求1．修饰剂的分子大小、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。2．修饰剂上反应基团的数目及位置。3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。在酶蛋白不变性的条件下有选择性地与氨基酸残基反应，易分离修饰后的衍生物以便进行测定。——根据修饰目的、专一性而定第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、反应条件的选择
反应条件应尽可能保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。——避免不可逆变性、有利于专一性修饰蛋白
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例。酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。3．反应温度及时间。严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日三、酶性质的了解1．酶活性部位情况。活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。2．酶的稳定条件、酶反应最适条件。热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。