第四节：生物大分子的浓缩沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等。吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。*第63页，共90页，星期日，2025年，2月5日超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。透析浓缩法减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。冰冻干燥法*第64页，共90页，星期日，2025年，2月5日在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。*第65页，共90页，星期日，2025年，2月5日超声波破碎的机理：一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，需在冰水或外部冷却的容器中进行。JY92-IID超声波细胞粉碎机*第31页，共90页，星期日，2025年，2月5日超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。*第32页，共90页，星期日，2025年，2月5日(4)压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(＜细胞直径的孔)，致使其被挤破、压碎。(5)冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。*第33页，共90页，星期日，2025年，2月5日2非机械破碎非机械方法很多1）酶解2）化学法溶胞3）物理法渗透压冲击冻结和融化干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。*第34页，共90页，星期日，2025年，2月5日四、酶解法Enymaticlysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等*第35页，共90页，星期日，2025年，2月5日外加酶法酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶。酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。*第36页，共90页，星期日，2025年，2月5日有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶