1958年，Meselsen/Stahl证实E.coli稳定同位素15N、14N培养基CsCl梯度离心表明：DNA在代谢上是稳定的，能保证亲代的遗传信息能稳定地传递给后代。第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日复制起点：AT富集区1.DNA复制的原点、方向与方式第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日方向：双向（真核生物，多数细菌、病毒）单向（噬菌体P2）原核生物：一个复制原点真核生物：多个复制原点第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日DNA复制方式从头起始即复制叉式复制在复制原点解开成两条单链，分别作为模板，合成互补链，出现复制叉。共价延伸先导链共价结合在一条亲本链上滚环式复制切断其中一条单链，5’端与蛋白质结合，3’端DNA聚合酶催化加核苷酸。3’端不断延长，5’端不断甩出。甩出单链到一定长度后，开始复制其互补链。第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日DNA聚合酶共同点：原料：脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）模板：DNA需要RNA引物：含3’-OH合成方向：5’-3’2.与DNA复制相关的酶和蛋白质第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日真核细胞：5种DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发，不具5’－3’外切酶活性）β（定位于核内，参与修复，不具5’－3’外切酶活性）γ（定位于线粒体，参与线粒体复制，不具5’－3’，有3’－5’外切活性）δ（定位核，参与复制，具有3’－5’，不具5’－3’外切活性）ε（定位于核，参与损伤修复，具有3’－5’，不具5’－3’外切活性）原核细胞：(大肠杆菌为例)5种DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（1956年Kornberg）、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ（1999年），都与DNA链的延长有关。第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌的3种DNA聚合酶DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ5’-3’聚合酶活性弱弱强3’-5’外切酶活性有有有5’-3’外切酶活性有（双链有效）无有（单链有效）亚基单体酶多亚基酶多亚基酶主要功能修复DNA损伤/复制时RNA引物切除及其缺口填补修复紫外线引起的DNA损伤DNA链的延长第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日DNA聚合酶催化反应第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日其他酶和蛋白功能拓扑异构酶引入或松开超螺旋DNA解旋酶使双链DNA解链单链结合蛋白稳定单链区引物合成酶合成RNA引物DNA连接酶连接DNA双链中的单链切口第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日3.DNA的复制过程（大肠杆菌为例）⑴DNA复制的起始①拓扑异构酶解开DNA超螺旋。②DnaA蛋白识别复制的起始位点（复制原点）。第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日③DNA解旋酶在ATP供能下，每分钟旋转3000次解开双螺旋。④单链结合蛋白结合在分开的单链上，避免产生单链内配对。⑤DNA拓扑异构酶解决由于复制叉推进产生的超螺旋问题。⑥引物合成酶合成RNA引物。第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日⑵DNA链的延长
在DNA聚合酶Ⅲ作用下，以四种脱氧核苷三磷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。
DNA聚合酶Ⅲ5’-3’聚合酶活性
前导链:连续合成
滞后链:分段合成
冈崎片段:在3′?5′方向链上，仍按从5′?3′的方向一段段地合成的DNA单链小片段(1000~2000bp)。第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日DNA聚合酶Ⅰ：切除RNA引物（5’-3’外切酶活性）填补缺口（5’-3’聚合酶活性）连接酶：连接冈崎片段形成一条连续的单链。第42页，共72页，星期日，2025年，2月5日⑶DNA复制的终止复制原点对面600kb终止区Ter序列（终止陷阱）:引起复制终止的序列。终止子利用物质Tus可识别并结合形成Ter–Tus复合物，阻止解旋酶的解旋，从而阻断复制第43页，共72页，星期日，2025年，2月5日4.真核生物DNA复制的特点原核生物真核生物DNA合成的时期整个细胞生长过程细胞周期S期复制起点单个多个（自主复制序列ARS）RNA引物长度10-60bp10bp冈崎片段长度100