不同pH范围胶条不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围pH7-11NL碱性胶条第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日宽pH、窄pH范围胶条宽pH梯度胶条应用: 整个蛋白图谱窄pH梯度胶条应用: 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白pH345678910456789第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日提高分辨率:斑点显现IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日不同长度的胶条7cm11cm13cm18cm24cm第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日2D/MS（蛋白质双向电泳）经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染考染荧光染色第35页，共48页，星期日，2025年，2月5日Coomassie?Blue-考马斯亮蓝染色+灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)+非特异性染色+染料与蛋白成比例结合+线性化好扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度纯度不够有限的动力学范围第36页，共48页，星期日，2025年，2月5日胶体考马斯亮蓝染色1mgE.colistrainBColloidalCBB
G250staining第37页，共48页，星期日，2025年，2月5日银染+灵敏度，低至0.2ng+在凝胶基质中与蛋白交联+自动催化反应线性化程度比考染低步骤多，某些步骤时间控制严格第38页，共48页，星期日，2025年，2月5日SilverstainedgelofE.coliLysateIPG4-7SilverstainedwithPlusOne?KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.第39页，共48页，星期日，2025年，2月5日第二次讨论第一题第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日PP宝藏T蛋白质双向电泳原理蛋白质双向电泳方法蛋白质双向电泳在医学的应用Westernblot第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日即蛋白质印迹法（免疫印迹试验)。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。westernblot第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日为更清楚地讲清采用蛋白质印迹法，下面我们通过一个实验（用蛋白质印迹法分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1（细胞色素的一种）的含量。）来为大家介绍蛋白质印迹法的应用主要在于蛋白质检测第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重↓按1g组织中加入冰预冷的10ml裂解液，10mMPMSF（苯甲基磺酰氟）1ml冰上制成10％的组织匀浆↓取1ml匀浆，4℃、离心30分钟↓小心吸取上清液↓取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20℃保存备用注意事项,样品裂解或匀浆处理不彻底，以及蛋白质沉淀不完全，，可能导致得率过低1.样品制备第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日考马斯亮蓝G—250是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G—250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。按下表操作。绘制标准曲线，计算测定管的浓度2.蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日装配好制胶玻璃板↓按下列配方配制12％的分离胶：将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED（四甲基乙二胺）。↓将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生