柱色谱操作（1）装柱。根据欲分离的物质性质选择适宜的色谱介质，装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢加入，一次用完。然后用几倍柱床体积的缓冲液平衡色谱柱。（2）加样。将平衡后的色谱柱从柱顶部或底部进样。（3）洗涤。用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与固定相结合的杂质洗涤下来。（4）洗脱。根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将目的物洗脱下来。（5）再生。目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。第30页，共85页，星期日，2025年，2月5日慢中等快柱分离淋洗液第31页，共85页，星期日，2025年，2月5日三、吸附色谱固定相：固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀粉、活性炭等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使混合溶液中各组分相互分离的方法。第32页，共85页，星期日，2025年，2月5日混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。第33页，共85页，星期日，2025年，2月5日在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因数Rf来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相的移动速度之比。Rf=溶质的移动速度/流动相的移动速度之比=溶质的移动距离/流动相的移动距离之比第34页，共85页，星期日，2025年，2月5日四、凝胶过滤色谱原理：按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。1.凝胶过滤色谱的分离机理固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；第35页，共85页，星期日，2025年，2月5日2.凝胶的种类和性质（1）葡聚糖凝胶商品名为Sephadex，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件下交联而成。主要型号是G-10～G-200。数字是凝胶的吸水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的10倍。（2）聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio-gel-P。主要型号有Bio-gel-P-2～Bio-gel-P-300等10种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量）的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。（3）琼脂糖凝胶（4）其他多孔玻璃珠和多孔硅胶等。第36页，共85页，星期日，2025年，2月5日3.凝胶色谱的应用（1）脱盐及除去小分热源物质子杂质和溶液的浓缩。（2）浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶液进行浓缩。（3）生物大分子的纯化及生化药物中热源物质的去除。（4）分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体积Ve与其分子量的对数成线性关系。第37页，共85页，星期日，2025年，2月5日五、离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第38页，共85页，星期日，2025年，2月5日第39页，共85页，星期日，2025年，2月5日第40页，共85页，星期日，2025年，2月5日六、亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第41页，共85页，星期日，2025年，2月5日薄层色谱原理2第42页，共85页，星期日，2025年，2月5日纸层析原理第43页，共85页，星期日，2025年，2月5日第四节结晶一、结晶的原理