LAMP技术在检测原料乳及乳制品中致病菌的应用

江苏食品药品职业技术学院

1检测乳中金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）广泛分布于自然界中，是食物中毒的主要致病菌之一，也是引起奶牛患病的重要因素，其中葡萄球菌肠毒素（Staphylo-coccalEnterotoxin,SE）是致病因子。SE对高温的耐受力强，100℃煮沸30min不受破坏。目前从金黄色葡萄球菌中检出SE达16种之多，但主要致病型为SEA和SED型。

2007年M.Goto[5]等人，在30株金黄色葡萄球菌中针对4种产肠毒素的基因SEA、SEB、SEC和SED进行LAMP方法的检测，发现LAMP方法可以在60min内检出，其灵敏度明显高于PCR方法。2010年，王德国等人应用LAMP技术针对原料乳中金黄色葡萄球菌femA基因的8个区域设计3对引物进行检测。全部反应在40min左右完成，检测限为每毫升菌液8~9个单细胞，检出率为96.43%。与之相比，应用PCR方法的检出率每毫升菌液8×106个单细胞。同年徐义刚等人，针对金黄色葡萄球菌不同菌株SEA基因设计4条特异引物，利用LAMP方法进行检测，检出率达100%。该方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为每毫升菌液25个单细胞，对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为每克菌液中42个单细胞。

2检测乳品中阪崎肠杆菌

阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）作为食源性条件致病菌，能够导致人类，尤其是婴幼儿和免疫力低下者患脓毒血症、脑膜炎、小肠坏死症等疾病。

目前，检测阪崎肠杆菌的方法主要为分离培养法，耗时长，FDA于2002年颁布的婴幼儿乳粉中检测阪崎肠杆菌推荐方法，检测周期长达一周，而且不同培养分离方法检出率差距很大。而应用LAMP技术能够在5h之内检测出复原乳样品中每毫升菌液中10个单细胞的阪崎肠杆菌，对其基因组DNA的检测灵敏度达到100fg。2009年，胡连霞等人用LAMP方法以16S-23SrRNA作为目的基因，在1h之内对纯培养菌体的检测限为每毫升菌液0.101个单细胞，对于人工污染婴儿乳粉的检测限为每克菌液1.1个单细胞；而作为对比，PCR方法需要3h的时间完成试验，检测限分别为每毫升菌液101个单细胞和每克菌液中1100个单细胞

3检测乳中沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和伤寒的主要致病菌，可以导致人畜共患病。由它引起的食物中毒最为常见，约占食源性食物中毒的75%。

传统分离培养方法费时、灵敏度低、操作复杂且易污染，而LAMP检测准确率高，比分离培养更快速，比PCR更灵敏。早在2008年朱胜梅等人就将LAMP技术应用于快速检测牛奶样品中的沙门氏菌。他们根据沙门氏菌的特异性invA基因设计引物进行扩增，检测灵敏度达到每毫升菌液102个单细胞。2009年XuefeiLi等人在对包括原料乳在内的85种食物样品进行沙门氏菌检测时发现，LAMP方法的检测限可以达到每250毫升菌液35个单细胞，检测准确性与传统培养方法达到100%吻合。并且用LAMP方法进行检测时全部试验及结果分析的时间大约为24h，与此相对传统PCR方法需要5~7d。2010年，Xu,Y-G等人利用LAMP方法，针对沙门氏菌的fimY基因进行检测。他们对包括乳制品在内的802个样品进行LAMP检测，其中165个样品LAMP检测为阳性。并发现对于纯培养的沙门氏菌，LAMP方法的检测限为每管菌液5个单细胞，对于人工污染食品中沙门氏菌的检测限为每管菌液9个单细胞。

4检测乳中单增李斯特菌

单核细胞增生性李斯特氏菌是一种人畜共患的食源性致病菌。在欧美、日本等国家由该细菌引起的食物中毒问题，已经超过沙门氏菌排名第一位。WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。根据2010年王德国等人的研究表明，利用LAMP方法对原料乳中单增李斯特菌的IAP基因进行检测，发现对于人工污染的原料乳而言，LAMP方法的检测限为每毫升菌液186个单细胞，这相当于每个反应管中8-10个细胞，并且检出率为91.67%。而用传统的PCR方法进行检测，检出限为每毫升菌液1.86×105个单细胞。可见，LAMP技术对单增李斯特氏菌检测灵敏度非常高，并有良好的特异性。

5检测乳品中大肠杆菌

大肠埃希氏菌（E.coli）通常称为大肠杆菌，是人和动物肠道的正常寄生性革兰氏阴性菌，多数不致病。但某些血清型的大肠杆菌，如肠出血性大肠杆菌，可引起严重的胃肠道和循环系统疾病，严重者甚至死亡。传统微生物学分离、鉴定方法包括选择性培养、生化和免疫、毒素的细胞学试验等，耗时长，操作复杂，而LAMP反应不超过1h就能完成。2007年，YukikoHara-Kudop等人在检