无忧PPT整理发布第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日主讲内容核酸分子杂交的基本原理核酸探针核酸分子杂交技术第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日一、DNA的变性（denaturation）变性：在一定的条件下，DNA双螺旋之间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA分子，此现象称为变性。第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。二、DNA的复性(renaturation)退火淬火第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日根据核酸变性和复性的原理，来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补配对形成异源双链杂交体的过程。三、核酸分子杂交杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。注：分子杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、RNA与DNA的两条单链之间进行。第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日核酸分子的浓度温度离子强度核酸分子的复杂性影响核酸分子杂交的因素第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日四、核酸分子杂交技术通过标记的单链核酸探针与固相支持物上或液相中单链的互补靶序列退火形成双链杂交体，而定性或定量检测特异DNA或RNA的技术。第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日第二节核酸探针核酸探针的概念核酸探针的类型核酸探针的标记核酸探针的检测方法第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日核酸探针(nucleicprobe)：指能够与待测的靶核酸片段互补结合的带有特殊可检测标记的核苷酸片段。一、概念第9页，共36页，星期日，2025年，2月5日按化学本质分：DNA探针RNA探针按标记物分：放射性标记探针非放射性标记探针按分子大小分：寡核苷酸探针单链探针双链探针二、核酸探针的类型第10页，共36页，星期日，2025年，2月5日二、常见核酸探针1.基因组DNA探针2.cDNA探针3.RNA探针4.寡核苷酸探针来源于某种生物的基因组，为某一基因的全部或部分序列。来源于cDNA,不含有内含子序列，适用于基因表达研究。大多以单链形式存在,杂交效率高。可通过体外转录技术获得。用化学合成技术在体外合成的单链DNA,长度一般为20-50bp。第11页，共36页，星期日，2025年，2月5日三、核酸探针的标记1.核酸探针的标记物（1）放射性核素标记物常用放射性核素标记物有：32P、35S、3H优点：①灵敏度极高,可检测到10-14～10-18g的物质，在最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量，光谱分析法只能鉴定10-9g的物质。②对碱基配对的特异性和稳定性无影响。③特异性高。缺点：放射性污染，有半衰期。第12页，共36页，星期日，2025年，2月5日32P或35S同位素标记的单核苷酸（α）（γ）（OH）HOH第13页，共36页，星期日，2025年，2月5日(2)非放射性标记物优点：无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放，处理方便。缺点：灵敏度、特异性不够理想。常用非放射性标记物有：生物素、地高辛、酶、荧光素第14页，共36页，星期日，2025年，2月5日2.核酸探针的标记方法（一）酶促法缺口平移法随机引物法DNA探针末端标记法（二）化学法预先标记酶促反应转移探针第15页，共36页，星期日，2025年，2月5日（1）缺口平移法（nicktranslation）由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。酶促法第16页，共36页，星期日，2025年，2月5日随机引物：含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物。（2）随机引物法（randompriming）酶促法第17页，共36页，星期日，2025年，2月5日在5’或3’端通过酶促反应加上标记物DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端标记法T4多核苷酸激酶5’末端标记法聚合酶链反应标记DNA探针RNA探