生物分离与提纯项目八亲和层析技术1
目录Contents02任务一认识亲和色谱1任务二制备亲和吸附剂2任务三亲和色谱操作方法3任务四亲和色谱的应用42
05任务三亲和层析操作方法3
亲和层析操作方法一、亲和层析操作条件的选择1.吸附条件的选择（1）吸附反应条件（2）流速的控制（3）吸附时间的控制（4）进样量的大小4
亲和层析操作方法一、亲和层析操作条件的选择2.清洗条件的选择洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附条件与目的分子洗脱条件之间。例如，如果目的生物大分子在0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中吸附，洗脱条件是0.6mol/L的氯化钠溶液，则可考虑用0.3mol/L的氯化钠溶液清洗。5
亲和层析操作方法一、亲和层析操作条件的选择3.洗脱条件的选择洗脱是使目的物与配基解吸并进入流动相流出柱床的过程。洗脱条件可以是特异性的，也可以是非特异性的。特异性洗脱条件是指在洗脱液中引入配基或目的生物大分子的竞争性结合物，使目的生物大分子与配基解吸。6
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法1.样品制备亲和层析样品的预处理程序的主要步骤：①除去颗粒、细胞碎片、膜片段等②样品的浓缩及除去蛋白酶或抑制剂2.配基与目的生物大分子结合条件的选择最适的pH缓冲液盐浓度离子强度7
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法3.柱操作目的生物大分子与杂质的分离效率往往取决于柱的长度。一般地说，高的容量可以用粗的短柱。但若目的生物大分子因非特异性的低强度结合，而被滞留在柱材料上，则需要采用较长的柱。8
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法4.流速的控制吸附操作要在适当的流速下进行，既要保证高速度，又要保证高效率。为了使纯化生物大分子能够得到尖的洗脱峰、最小的稀释度和最大的回收率，一般使用较低流速。9
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法5.清洗清洗操作的目的是洗去吸附剂内部及柱空隙中潴留的杂质。具体的操作是样品吸附在柱上之后，用几倍体积的起始缓冲液对柱清洗以除去不结合的所有物质。对于以静电作用吸附在柱上的非特异性结合物质，可用稍微增加离子强度的缓冲液淋洗去掉。10
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法6.洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与目的生物大分子或与配基的亲和特性，将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来一种是选择与配基有亲和力的物质进行洗脱另一种是选择与目的生物大分子有亲和力的物质进行洗脱11
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法6.洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配基的亲和结合力而将待分离物质洗脱下来①当目的生物大分子与配基亲和力较小时②当目的生物大分子和配基结合较强时③对于目的生物大分子与配基结合非常牢固时12
亲和层析操作方法二、亲和层析基本操作方法7.柱的再生为分离纯化下一批原料液，需要利用清洗液清洗再生层析柱，使层析柱的物理环境适合目标产物的亲和吸附。具体操作是用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般可使亲和柱再生。13