从软体动物贝类的血液中提取到2种富含阳离子与胱氨酸的抗菌小肽,其中1种含有34个氨基酸残基,命名为Mytilin,结构如下:Gly-Cys-Ala-Ser–Arg-Cys-Lys-Ala-Lys-Cys-Ala-Gly-Arg-Arg-Cys-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Cys-Phe-Arg-Cys;另一种含35～43个氨基酸残基,属于昆虫防御家族肽,与上述的Mytilin的结构相似,它富含8个胱氨酸，具有广谱抗细菌、抗真菌活性。第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日牡蛎软体中抗菌蛋白的制备及活性研究材料：长牡蛎、大连湾牡蛎和近江牡蛎的肉菌株溶壁微球菌、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、金黄色葡萄球菌[JP-04-08、ATCC25922]、表皮葡萄球菌BP-04-18、大肠埃希氏菌[PC-04-21、ATCC25923]、铜绿假单胞菌[LN-04-12、ATCC27853]、变形杆菌BX-04-10、肺炎克雷伯杆菌、肠球菌、不动菌属。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853。文献阅读美国模式培养物保藏所中国生物制品检定所第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日方法1.抗菌蛋白的制备1.1粗蛋白的制备：取鲜活牡蛎5~10kg,以纯水冲洗后取牡蛎软体,洗净沥干约500g，经粉碎、低温研磨过100目筛,按重量比(w/w)1∶1加入注射用水,在1~4℃搅拌提取6~8h,匀浆液离心(4000r/min,40min),得蛋白粗提上清液。1.2液体浓缩蛋白的制备：将获得的粗提液采用SMB220生物型错流超滤系统分级(膜截留分子量为50kDa),再以截留分子量为10kDa的膜浓缩5倍。浓缩液密闭存放或制备成冻干粉。第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日1.3蛋白的分离纯化：取超滤浓缩液2.0ml,上样于pH3.8柠檬酸-Na2HPO4缓冲液充分平衡后的CM-SepharoseFF层析柱(2.5cm×10cm)进行层析,用200ml含0-1.0mol/LNaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩后，上样到以pH6.5NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液充分平衡的SephadexG-100层析柱(1.6cm×60cm)进行层析,用平衡液进行洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩后－20℃保存备用。以上纯化操作均在4℃进行。第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日2抗菌蛋白性质分析2.1纯度和分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定：蛋白浓缩液(10μl,15μl)直接上样进行SDS分析,分离胶浓度为15％,电泳条件:电压200V,56min,用0.5％考马斯亮蓝R250染色,使用不同分子量的标准蛋白对抗菌蛋白进行分子量及其分布测试及分析。采用SDS方法测定：纯化蛋白测定，分离胶浓度为12%,用0.5%考马斯亮蓝R250染色。2.2含氮量测定取3批次(20030502120040411)牡蛎海洋溶菌酶冻干粉按照中华人民共和国药典(2000年版二部)附录ⅦD氮测定法测定。第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日3体外实验3.1最低抑菌浓度（MIC)测定 采用平皿二倍稀释法和Denlay多点接种器进行药敏试验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌;抗菌蛋白海洋低温溶菌酶用水解酪蛋白琼脂(MH)肉汤二倍稀释成各种所需浓度,分别加适量至平皿中，MH培养基熔化后定量注入含药液平皿内混匀：生孢梭菌最终浓度为15×106cfu/ml,白色念珠菌18×106cfu/ml,其他菌液为1×105cfu/ml,需氧菌37℃培养18h,真菌20~25℃培养48h,厌氧菌置厌氧孵箱30~35℃孵育48h后观察结果,无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为MIC。3.2最低杀菌浓度MB测定 采用试管二倍稀释法,先测出试验菌的MIC,再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取0.1ml,转移到不含药液的琼脂平皿中,培养条件同MIC测定,观察测定结果,平皿上菌落数5个的最小药物浓度即为MBC。第67页，共93页，星期日，2025年，2月5日4透射电镜观察抗菌蛋白对大肠埃希氏菌超微结构的变化试验以正常大肠埃希氏菌培养12h制备透射电镜样品作阴性对照组。以LB液体培养基将抗菌蛋白稀释成1.25mg/ml,加入对数生长期