原生质体融合后的个体称为融合体。同种原生质体间的融合称为同源融合，该融合体称为同核体(homokaryon)；非同种原生质体间的融合称为异源融合，该融合体称为异核体。第62页，共104页，星期日，2025年，2月5日(2)不对称融合通过物理或化学方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活，或同时也使另一方细胞质基因组失活，再进行原生质体融合，获得只有一方亲本核基因的不对称杂种的技术(图7-3)。无核的亚原生质体称为胞质体(cytoplast)，有核的小原生质体(miniprotplast)或只有核和原生质膜构成的亚原生质体称为核质体(karyoplast)。对称融合技术在实现双亲优良性状重组的同时，无法排除不良性状，也不能单独利用一方的核基因或细胞质基因。而不对称融合技术能够通过物理方法(如X射线、丫射线、紫外线照射)或化学方法(如碘乙酸、Rhodamine6—G)处理原生质体，使其细胞核失活或不能正常分裂，细胞质基因组正常，来培育不对称杂种，第63页，共104页，星期日，2025年，2月5日(3)微原生质体融合微原生质体融合技术又称为微核技术(micronucleustechnology)，是指以植物细胞经微核化处理后形成的、外包有被膜、内含一条或几条染色体的微核作为供体，与受体原生质体融合，从而实现部分基因组转移的技术(图7—3)。微原生质体融合技术是近年来开发的一项新技术，可用于克服生殖隔离，转移多基因性状或未知基因性状，获得单体或二倍体附加系，建立特异染色体DNA文库以及研究外源基因的功能等。迄今，该技术已成功地用于马铃薯和番茄间单条或多条染色体的转移。第64页，共104页，星期日，2025年，2月5日2．融合方法细胞融合方法主要分为化学融合法和物理融合法。化学融合法是指以化学试剂作为融合诱导剂，诱导原生质体融合的方法，主要有PEG融合法和高钙一高pH法等。物理融合法是指用电激、离心、振动等机械方法来促使原生质体融合的方法，主要有电融合法和超声波法等。第65页，共104页，星期日，2025年，2月5日(1)PEG融合法PEG融合法是高国楠等人在1974年开创的利用PEG作为诱导融合剂进行细胞融合的技术。该技术因其操作简便，融合效果较好，不需要昂贵的仪器设备，因而被广泛采用。迄今所得到的体细胞杂种，多数是利用该技术。PEG处理后再用高Ca2+一高pH溶液代替其他溶液洗除PEG，能大大提高融合率。一般选用的PEG相对分子质量在1540～6000之间，浓度10％～30％(W／V)。PEG融合法的具体操作过程如下：①器具灭菌。把必要数量的培养皿(一般6cmXl．5cm)、移液管、离心管等用具高温灭菌后，放在超净台内备用。第66页，共104页，星期日，2025年，2月5日②原生质体制备选择合适的原生质体供体材料，配制适宜的酶液组合，分离原生质体。将制备好的双·亲原生质体悬浮于0.4～0.6mol／L的Mannitol液中(含CaCl2·2H20500mg／L+KH2P04100mg／L，pH5.8)，分别调整好密度(一般为2×105个／m1)，等比例混合。③制备PEG液和稀释清洗液。根据实验材料选择分子量合适的PEG并确定其浓度，配制PEG溶液。稀释清洗液主要由CaC2·2H20和Mannitol组成。第67页，共104页，星期日，2025年，2月5日④原生质体融合两种原生质体悬浮液(一般各取lml)等体积混合于培养皿中，静置沉淀5min，四角(或一侧)滴人等量(2ml)PEG液并用吸管诱导接触、混匀，镜下观察决定融合时间。最佳处理时间为大部分原生质体吸附成二体、少量出现三体时，开始分次加稀释清洗液，最后用培养用液体培养基洗一次。⑤原生质体培养。培养方法见原生质体培养一节。第68页，共104页，星期日，2025年，2月5日采用PEG融合法时应注意：①PEG相对分子质量大凝聚力则强，能缩短融合处理时间，小于1000一般不能使原生质体凝聚，常用相对分子质量1540；②稀释液可用Mannitol液、高Ca2+一高pH液；③双亲的原生质体最好选用外观能区分开的两种细胞；④操作过程中要动作迅速，融合后要轻拿轻放。第69页，共104页，星期日，2025年，2月5日(2)高钙一高pH法该方法是Keller等1973年开发出的。在高Ca2+一高pH液的诱导下，原生质体吸附、聚合，最后融合在一起。具体操作与PEG法类似，不同点只是用高钙(0．03mol／L)和高pH(9.5～10.5)液取代PEG液，高pH有利于原生质体聚集接触。Keller等人采用该方法进行烟草叶肉原生质体融合，获得了品种间的体细胞杂种。第70页，共104页，星期日，2025年，2月5日(3)电融合法该方法是Zi