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非洲猪瘟超快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了非洲猪瘟超快速荧光PCR检测方法。
本文件适用于猪组织、猪全血、动物产品和环境样品中非洲猪瘟病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1超快速荧光PCRultra-fastReal-timePCR
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40℃/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8~15min内完成45个循环检测。
4缩略语
下列缩略语适合本文件。
PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）
Ct值：阈值循环数（Cyclethreshold）
DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）
F：上游引物（Forwardprimer）
R：下游引物（Reverseprimer）
P：探针（Probe）
BHQ2：黑洞淬灭剂2（BlackHoleQuencher1）
FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）
MGB：MinorGrooveBinderQuencher淬灭基团
ROX：羧基-X-罗丹明（Carboxy-X-Rhodamine）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution）
ASFV：非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus）
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EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）
5试剂和耗材
5.1试剂
5.1.1除另有说明，所用试剂均为分析纯。
5.1.2PBS（pH=7.2）液配制方法见附录A中A.1。
5.1.3阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.2。
5.1.450%甘油-PBS保存液，配制方法按照附录A中A.3。
5.1.5阳性对照为非洲猪瘟B646L基因序列重组质粒，制备方法见附录B中B.2。
5.1.6内参为猪GAPDH基因重组质粒，制备方法按照附录B中B.4。
5.1.7超快速荧光PCR预混液（包含5×PCRbuffer、Mg2+、dNTP）。
5.1.8快速启动聚合酶（5U/μL）。
5.1.9DNA提取试剂盒。
5.1.10超快速荧光PCR板。
5.1.11青霉素，浓度为10000IU/mL。
5.1.12链霉素，浓度为10000μg/mL。
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（非洲猪瘟病毒和内参基因序列）上、下游引物和探针序列参见附录C.1。
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪。
6.2移液器（量程：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）。
6.3生物样品均质器。
6.4冷冻高速离心机。
6.5Ⅱ级生物安全柜。
6.6高压灭菌器。
6.7pH计。
7样品采集与处理
采样及样品前处理过程须戴一次性手套，样品不得交叉污染。实验室生物安全符合GB19489规定。
7.1采样工具
解剖刀、剪刀、镊子、棉拭子、离心管（2mL、10mL）、研磨管等采样工具需经121℃(±2℃)高压灭菌15min。真空采血管（含EDTA抗凝剂）。
7.2样品采集
7.2.1口、鼻拭子采集
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用棉拭子在口腔或鼻腔转动来回刮2次～3次，采集口腔或鼻腔的分泌物，随后立即将棉拭子放入装有1.0mL50%甘油-PBS液的保存管中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。
7.2.2环境拭子采集
将棉拭子在物体表面来回刮2次～3次，每支棉拭子分别放入装有1mL50%甘油-PBS液的保存管中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。
7.2.3全血样品采集
使用真空采血管（含EDTA抗凝剂），采集猪猪血5mL，密封后冷藏或冷冻保存。
7.2.4组织样品采集
采集猪组织样品，首选脾脏，其次为扁