T/GDAAV0112—2025
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鱼类无乳链球菌超快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了鱼类无乳链球菌的超快速荧光PCR检测方法。
本文件适用于鱼组织样品、鱼苗、细菌培养物、养殖池塘水、环境等样品中无乳链球菌的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SC/T7014水生动物检疫实验技术规范
SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1超快速荧光PCRultra-fastReal-timePCR
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40℃/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8-15分钟内完成45个循环检测。
4缩略语
下列缩略语适合本文件。
PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）
Ct值：阈值循环数（Cyclethreshold）
DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）
F：上游引物（Forwardprimer）
R：下游引物（Reverseprimer）
P：探针（Probe）
BHQ1：黑洞淬灭剂1（BlackHoleQuencher1）
BHQ2：黑洞淬灭剂2（BlackHoleQuencher2）
FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）
Cy5：近红外荧光染料（Near-infraredfluorescentdyes）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution）
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5试剂和耗材
5.1试剂
5.1.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682二级水的要求。
5.1.2PBS（pH7.2）配制方法按照附录A中A.1。
5.1.3阳性对照分别采用无乳链球菌标准菌株，配制方法按照附录A中A.2。
5.1.4内参为健康鱼肉组织（不含无乳链球菌）。
5.1.5阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.3。
5.1.6超快速荧光PCR预混液（包含5×PCRbuffer、Mg2+、dNTP）。
5.1.7快速启动聚合酶（5U/μL）。
5.1.8超快速荧光PCR反应板。
5.1.9DNA提取试剂盒。
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（无乳链球菌和内参）上、下游引物和探针序列参见附录B.1。
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪。
6.2移液器（量程：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）。
6.3生物样品均质器。
6.4冷冻高速离心机。
6.5Ⅱ级生物安全柜。
6.6高压灭菌器。
6.7pH计。
7样品采集与处理
采样及样品前处理过程须戴一次性手套，样品不得交叉污染。实验室生物安全符合GB19489规定。
7.1样品采集
7.1.1采样工具
剪刀、镊子、1.5mL离心管、研磨管等采样工具经过121℃(±2℃),高压灭菌15min，冷却后，烘干，备用。采样瓶使用前用5%HCL溶液浸泡1h以上，0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水漱洗，密闭包装后置高压灭菌锅，121℃(±2℃),高压灭菌20min，冷却后，烘干，备用。
7.1.2待检样本
待检样品可包括鱼组织，养殖池塘水、环境拭子。鱼组织：用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官组织（采样数量、个体要求等应符合应符合SC/T7014的规定）。养殖池塘水：取待检水样50mL于灭菌的采样瓶中。环境拭子：采集环境拭子时，将拭子来回刮2次～3次。
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7.1.3样品运输
样品运输应符合SC/T7103的规定。
7.2样品前处理
7.2.1内参的制备
取绿豆大小（约150mg）的健康且未感染无乳链球菌的鱼肉，放置于匀浆管内，匀浆后待用或-20℃保存备用。
7.2.2池塘水样品前处理
取水样1mL，12000r/min离心1min，弃上清，沉淀物用于核酸提取或-20℃保存备用。
7.2.3环境拭子前处理
每支拭子加入1mLPBS溶液，充分震荡混匀