蛋白质的分离纯化与结构分析;一、蛋白质的提取;微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量;2.组织细胞的粉碎;第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日;超声波细胞破碎仪;3.蛋白质的分离纯化;（一）水溶液提取法;1.pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化.
一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2.盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。;（二）有机溶剂提取法;二、蛋白质的分离纯化;（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法;丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法;影响盐析的因素：;2.等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3.低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
4.低温沉淀;（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法;2.透析与超滤
;;3.应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离;离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。
凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。;第21页，共51页，星期日，2025年，2月5日;（三）根据蛋白质带电性质进行分离;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。
等电聚焦电泳，通过蛋白质等???点的差异而分离蛋白质的电泳方法。
双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。
免疫电泳，把电泳和抗原与抗体反应的特异性相结合，常用于蛋白质的鉴定和纯度的检查。;第24页，共51页，星期日，2025年，2月5日;值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。;第26页，共51页，星期日，2025年，2月5日;2.离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。;第28页，共51页，星期日，2025年，2月5日;（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法;三.蛋白质的鉴定与含量分析;应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列;通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列;同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。
折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。
从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。;;三级结构测定
X射线衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。;二级结构测定
通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。;（三）蛋白质含量测定
1.凯氏定氮法(Kjedahl法)
2.福林-酚试剂法(Lowry法)
3.双缩脲法
4.紫外分光光度法
5.BCA比色法
6.Bradford蛋白分析法;1.凯氏定氮法(Kjedahl法);2.福林-酚试剂法(Lowry法);4.紫外分光光度法;5.BCA比色法;6.Bradford蛋白分析法;（四）生物活性分析法(ELISA)
酶联免疫吸附实