第1页，共35页，星期日，2025年，2月5日PCR技术的基本原理第2页，共35页，星期日，2025年，2月5日PCR的反应动力学PCR反应最终的DNA扩增量,Y＝(1＋X)nY:DNA片段扩增后的拷贝数X:每次扩增效率的平均值n:循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。第3页，共35页，星期日，2025年，2月5日平台期(Plateau)反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期产生的因素:①dNTP和引物浓度下降②酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降③多次循环后酶与dNTP的稳定性下降④非特异产物及引物二聚体比例增加⑤产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，产物浓度过高10－8M时，降低Taq酶的延伸与加工能力。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR反应应在平台期前结束。第4页，共35页，星期日，2025年，2月5日PCR扩增产物长产物片段和短产物片段短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成.在一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3‘端开始延伸，其5’端是固定的，3‘端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5‘端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计第5页，共35页，星期日，2025年，2月5日酶及其浓度TaqDNA聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。除TaqDNA聚合酶，还有其它一些热稳定聚合酶。催化一典型的PCR反应约需酶量5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，甚至PCR产物为弥散，浓度过低则合成产物量减少。第6页，共35页，星期日，2025年，2月5日第7页，共35页，星期日，2025年，2月5日dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris－HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，因此浓度过高，使游离的Mg2+浓度降低，并抑制Taq酶活性。第8页，共35页，星期日，2025年，2月5日Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响Mg2+浓度要比dNTP浓度高0.2～2.5mM。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。2mMMgCl2在dNTP为0.7-0.8mM时,对Taq酶活性促进最强10mM时对Taq酶抑制达40-50%模板和引物中磷酸根结合Mg2+,将降低自由Mg2+KCl(50mM)可使Taq酶活性增加50-60%.第9页，共35页，星期日，2025年，2月5日模板(靶基因)核酸DNA与RNA均可成为PCR的模板。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一PCR的模板可以纯化也可以是粗提液。但不管是什么类型在模板中均不应存在Taq酶抑制剂。模板量要求为102－105靶序列。一般对于单拷贝模板来讲，高等真核生物基因约需1ug,酵母约需10ng，质粒或大肠杆菌需要量1ng。第10页，共35页，星期日，2025年，2月5日引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷