PCR技术在基础研究中的应用一、目的基因的克隆RT-PCR、Nested-PCR、RACE与反转录反应相结合,直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片断利用特异性引物从基因组DNA或者cDNA获得已知目的基因片断利用随机引物从cDNA或者基因组文库中克隆基因二、体外突变嵌和、缺失、点突变第29页，共78页，星期日，2025年，2月5日PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭（嵌入）染色紫外光检测分子量参照第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日PCR产物电泳第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日五、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日Real-timePCR利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它已逐渐代替了Northernblot以及RT-PCR技术。第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日实时PCR技术原理第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日PCR引物实时PCR技术原理第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日报告基团淬灭基团第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日无荧光信号产生能量激发光完整的探针：5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移）第39页，共78页，星期日，2025年，2月5日变性(95oC)第40页，共78页，星期日，2025年，2月5日退火(60oC)第41页，共78页，星期日，2025年，2月5日延伸(72oC)第42页，共78页，星期日，2025年，2月5日第43页，共78页，星期日，2025年，2月5日第44页，共78页，星期日，2025年，2月5日?第45页，共78页，星期日，2025年，2月5日5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来第46页，共78页，星期日，2025年，2月5日第47页，共78页，星期日，2025年，2月5日第48页，共78页，星期日，2025年，2月5日第49页，共78页，星期日，2025年，2月5日第50页，共78页，星期日，2025年，2月5日第51页，共78页，星期日，2025年，2月5日第52页，共78页，星期日，2025年，2月5日第53页，共78页，星期日，2025年，2月5日第54页，共78页，星期日，2025年，2月5日第55页，共78页，星期日，2025年，2月5日第1页，共78页，星期日，2025年，2月5日
第一节
聚合酶链反应
PolymeraseChainReaction第2页，共78页，星期日，2025年，2月5日聚合酶链反应
(PolymeraseChainReaction,PCR)1983年,美国PECetus公司的KaryMullis建立了PCR技术,使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍,KaryMullis因此获1993年度诺贝尔化学奖.第3页，共78页，星期日，2025年，2月5日KaryMullis(1985)发明过程Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。第4页，共78页，星期日，2025年，2月5日PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获第5页，共78页，星期日，2025年，2月5日原理类