Southern杂交是将待测DNA分子酶切后变性，转移至适当的滤膜上用已标记的单链DNA或RNA探针杂交以检测这些被转移的DNA片段。Northern杂交是将RNA分子变性及电泳分离后再用探针进行检测。第62页，共99页，星期日，2025年，2月5日斑点印迹杂交是将变性的DNA或RNA核酸样品直接转移到适当的杂交膜上，然后加探针进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异的DNA片段或RNA片段。菌落原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有目的基因的菌落或噬菌斑。第63页，共99页，星期日，2025年，2月5日第64页，共99页，星期日，2025年，2月5日3.5.4免疫化学筛选法免疫化学筛选法是用抗体作为探针，而非DNA或RNA探针来鉴定目的基因的表达产物。免疫化学筛选法分为放射性抗体筛选、非放射性抗体筛选法和免疫沉淀筛选法。第65页，共99页，星期日，2025年，2月5日（1）放射性抗体筛选在放射性抗体筛选法中，先将待检测的菌落或噬菌体按原位印迹到硝酸纤维素膜上，裂解细胞使目的蛋白抗原释放并结合在膜上，然后与第一抗体反应生成抗原-抗体复合物。第66页，共99页，星期日，2025年，2月5日接着再用放射性125I标记了的第二抗体（抗第一抗体中特异性抗原决定簇的抗体）直接检测，去除过剩的第二抗体，薄膜干燥后放射性自显影，即可显示出是否有所需的重组体。第67页，共99页，星期日，2025年，2月5日放射性抗体检测法过程第68页，共99页，星期日，2025年，2月5日（2）非放射性抗体筛选由于放射性物质的半衰期短和安全问题，研究人员开发出了非放射性标记物。如第二抗体可用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶相偶联，检测目的蛋白抗原-抗体复合物，或者也可用于辣根过氧化酶偶联的抗生物素蛋白来检测与生物偶联的第二抗体等。第69页，共99页，星期日，2025年，2月5日待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶第70页，共99页，星期日，2025年，2月5日第30页，共99页，星期日，2025年，2月5日1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（5）DNA接头(adapter)连接法第31页，共99页，星期日，2025年，2月5日Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接第32页，共99页，星期日，2025年，2月5日第33页，共99页，星期日，2025年，2月5日3.4.2重组分子的转移重组分子构建完成后，必须导入到合适的受体细胞，才能实现复制、扩增和表达。受体细胞又称为宿主细胞，是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。第34页，共99页，星期日，2025年，2月5日将重组分子导入受体细胞的方法有很多种，如转化、转染、显微注射和电穿孔等多种方式，在转移重组分子时根据受体细胞的区别选择合适的导入方法。一般原核细胞和低等真核细胞作受体时主要用转化和转染法，而高等动植物的真核细胞作受体时主要用显微注射和电穿孔法。第35页，共99页，星期日，2025年，2月5日感受态制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的0.1mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的0.1mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的0.1mMCaCl2重悬第36页，共99页，星期日，2025年，2月5日（1）重组分子转入原核细胞热激法转化（Ca2+有助于转化）往感受态细胞中加入重组DNA分子置冰浴中培养30min后42℃热休克90s实现感受态细胞对重组DNA分子的吸收。第37页