重组胶原蛋白在不同离体皮肤渗透性差异研究
在医学与化妆品领域，皮肤渗透性研究一直占据着重要地位。在医学上，了解皮肤渗透性对药物经皮吸收效果的影响，有助于开发更有效的透皮治疗方案[1]。而在化妆品领域，皮肤渗透性则关乎各类功效成分能否安全且有效地作用于皮肤深层[2]。离体皮肤模型被广泛应用于研究皮肤的渗透性[3，4]。
然而，不同种属来源以及同一种属不同部位的离体皮肤，其结构和功能存在显著差异，这些差异会直接导致皮肤渗透性的不同[5，6]。
目前，离体猪皮和离体鼠皮是最为常用的代替人体皮肤的模型。然而，离体猪皮在组织结构上与人体皮肤较为相似。离体鼠皮成本低、易获取，在初步筛选研究中被广泛应用，二者在结构和功能上存在差异，对化妆品成分的渗透性表现也存在着差别[5，7，8]。
本研究通过Franz扩散池研究RHCⅢ在两种离体皮肤渗透量的差异，并借助二次谐波（secondharmonicgeneration，SHG）结合双光子荧光（two-photonexcitedfluorescence，TPEF）成像技术直观呈现RHCⅢ在两种离体皮肤透皮行为的差异，明确这两种离体皮肤的渗透性差异，对于化妆品的配方优化、安全性评估以及功效预测有着重要意义。本研究旨在深入探讨离体猪皮和离体鼠皮的渗透性差异，为化妆品的透皮性能测试方面提供科学依据。
1.1材料、试剂与仪器
RHCⅢ（分子量55kDa，纯度≥95%），江苏江山聚源生物技术有限公司；BCA试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；iFluor?405succinimidylester，AATBioquest；透析袋（lt;1kDa），南京森贝伽生物科技有限公司。TK-12D透皮扩散仪（药物透皮试验仪），上海玉研科学仪器有限公司；SpectraMaxM2e型多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；LSM880NLO双光子激光共聚焦显微镜，卡尔蔡司光学有限公司；LeciaCM1950冷冻切片机，徕卡显微系统（上海）贸易有限公司。
1.2离体皮肤采集
离体猪皮由邳州市东方养殖有限公司提供，取自巴马香猪（合格编号：202360244），离体鼠皮取自6～8周龄SD大鼠。取皮前清洗全身皮肤，电动脱毛器小心剃去背部皮肤的被毛，切断巴马香猪前肢动脉使其缺血致死（大鼠断颈处死），剥离背部皮肤，把皮肤平铺在干净的玻璃板上，让角质层向下，用小刀片沾生理盐水剔除皮下脂肪、组织和毛细血管，然后用生理盐水反复冲洗干净、擦干，用铝箔纸包裏置于储存袋中，-20℃保存备用。
1.3重组胶原蛋白皮肤透过量分析
1.3.1受试物制备
取RHCⅢ100mg，溶于10mL生理盐水中，配制为质量分数1%溶液，蛋白质溶液的浓度为10mg/mL。
1.3.2皮肤暴露与蛋白含量测定
开启透皮扩散仪，调节转速为300r/min，水浴温度达到（32±0.5）℃。接收池加入8mL的生理盐水，将解冻好的两种离体皮肤从储存袋中取出，用生理盐水洗净后再用吸水纸将皮肤表面的水分沾干，裁剪为2.5cm×2.5cm的正方形。将猪皮和大鼠皮固定于扩散池的供给室与接受池之间，角质层朝上，排尽接收池内的气泡，扩散池组装好后平衡20min。两种离体皮肤均设置生理盐水对照组和受试物组（RHCⅢ组），对照组供给池加入1mL生理盐水，受试物组供给池加入1mLRHCⅢ溶液，每组设三个平行。将扩散池放入水箱上部相应槽孔内，于第1h、2h、4h、6h、8h、12h从接收池中取样1mL，将样液置于试管中，然后向接收池补充1mL生理盐水。
采用BCA法分析接收液中的蛋白质含量。接收液按下列公式计算各时间点的单位面积累积透皮渗透量（Qn，mg/cm2）。式中，Qn为单位面积累积透皮量，Cn为第n次取样时蛋白质浓度，V为接收池体积（8mL），Ci为第i次取样时蛋白质浓度，Vi为第i次取样时取样体积，A为有效接触面积（2.2cm2）。
1.3.3数据统计与分析
使用Origin21软件进行数据处理，采用独立样本Studentst-test检验，plt;0.05表示差异有统计学意义。
1.4重组蛋白荧光成像
1.4.1荧光标记
取RHCⅢ100mg溶于10mL1M磷酸盐缓冲液（pH8.5–9.0）制备RHCⅢ的10mL蛋白标记储备液。向iFluor405（1mg）中加入无水DMSO1mL得到荧光染液。然后，将1mL的荧光染液加入蛋白标记储备液中并充分摇动。将反应混合物在4℃下旋转12h。将反应混合物装入透析袋（lt;1kDa）中并在黑暗中置于含有超纯水的大烧杯中。每2h更换一次水，直到在超纯水中没有检测到荧光，透析袋内溶液荧光强度不再变化，说明游离的未被标记的荧光染料已全部被析出，将反应混合物取出得到iFluor-RHCⅢ。
将1mL的荧光染液加入10mL1M磷酸盐缓冲液（pH8.5–9.