实验一分光光度技术及蛋白含量测定第1页，共28页，星期日，2025年，2月5日理论掌握分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本构造实验利用分光光度计进行蛋白质定量测定1.双缩脲法测定蛋白质含量2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量3.紫外分光光度法测定蛋白质含量本次实验内容第2页，共28页，星期日，2025年，2月5日分光光度技术（Spectrophotography）第3页，共28页，星期日，2025年，2月5日一、基本定义利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。应用：定性、定量优点：灵敏度高精确度高操作简便、快速第4页，共28页，星期日，2025年，2月5日二、工作原理1.物质对光线有选择性吸收作用。2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。分光光度法所使用的光谱范围：200nm--10μm200-400nm400-760nm760-10000nm紫外光区可见光区红外光区第5页，共28页，星期日，2025年，2月5日如何定性？
—利用吸收光谱鉴定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性的吸收光谱第6页，共28页，星期日，2025年，2月5日1.朗伯（Lambert）定律一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。I/I0=e-K1lI0:入射光强度；I:透射光强度；l：介质厚度如何定量？
—Lambert-Beer定律第7页，共28页，星期日，2025年，2月5日2．比尔（Beer）定律一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。I/I0=e-K2CI0:入射光强度；I:透射光强度；C：介质浓度第8页，共28页，星期日，2025年，2月5日3.Lambert-beer’slaw的合并一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。I/I0=e-εclA=-lgI/I0=εclA：吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度ε：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为mol/L,光程为1cm时的消光系数第9页，共28页，星期日，2025年，2月5日4.计算（1）标准管法（标准比较法）实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。A标准=ε标准C标准L标准A样品=ε样品C样品L样品A：吸光度；ε：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度第10页，共28页，星期日，2025年，2月5日因标准液和样品液中溶质为同一物质，ε样品=ε标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同L样品=L标准故上二式可写成：A标准/A样品=ε标准C标准/ε样品C样品C样品=A样品/A标准×C标准第11页，共28页，星期日，2025年，2月5日（2）标准曲线法配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。第12页，共28页，星期日，2025年，2月5日标准曲线使用注意事项①标准曲线范围在测定浓度