蛋白质组与蛋白质结构分析;难点
;第一节引言;随着人类基因组及诸多物种基因组计划的完成，生命科学研究已经进入以基因组学、蛋白质组学、代谢组学等“组学”为研究标志的后基因组时代（post-genomicera）。在后基因组时代，蛋白质组学研究越来越受到关注和重视。;蛋白质组（proteome）：指由一个基因组（genome），或一个细胞、组织表达的所有蛋白质（protein）。
蛋白质组学（proteomics）：蛋白质组学是采用大规模、高通量、系统化的方法，研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成、功能及其蛋白之间相互作用的学科。
根据不同研究目的和手段，蛋白质组学分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。;
①表达蛋白质组学：主要采用经典蛋白质组学技术如双向凝胶电泳和图像分析技术，开展细胞内蛋白样品表达的定量研究；
②结构蛋白质组学：以绘制出蛋白复合物结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目标的蛋白质组学，主要用于建立细胞内信号转导网络图谱并解释某些特定蛋白表达对细胞产生的特定作用；;
③功能蛋白质组学：以细胞在某一特定时间所表达或与某个功能相关的蛋白质集合为研究对象进行研究和描述，能够提供有关蛋白糖基化、磷酸化，蛋白信号转导通路，疾病机制或蛋白-药物之间相互作用的重要信息。;第二节
蛋白质组数据的获取与分析;一、二维凝胶电泳分析技术;样品经过电荷和质量两次分离后，可获得样品分子等电点（isoelectricpoint，pI）和分子量（molecularweight，MW）等信息。
分离的结果不是获得蛋白条带，而是蛋白斑点。
这是迄今分辨率最高、信息最多的蛋白电泳技术。目前使用广泛的2-DE蛋白分离的方法为固相pH梯度-SDS双向凝胶电泳。;1.样品制备
目的是从成分复杂的细胞、组织等材料中取得纯度高的完整蛋白质组分。
;2.蛋白质定量
BCA法、Bradford法及UV280法等，但由于这些定量方法都基于吸光度测定，而样品溶液中往往含有高浓度尿素等溶剂可能影响吸光度的准确测定，故推荐使用双向电泳蛋白质定量专用试剂盒进行检测。
;3.一向电泳
一向电泳等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）???是根据蛋白质pI值不同，在电场力的作用下将其分离。;4.一向胶条的平衡
进行第二向电泳前，需要对IPG胶条进行平衡（equilibration），平衡过程是将IPG胶条浸没在第二向电泳所必需的SDS缓冲体系中，以便被分离蛋白质与SDS完全结合并顺利转移入二向电泳的凝胶中。平衡后应立即进行第二向电泳。;5.二向电泳
即十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是根据分子量大小各异的蛋白质在电场中的泳动速率不同的原理而分离蛋白质的方法。;6.凝胶检测
适用于SDS凝胶中蛋白质检测的方法都可用于双向电泳凝胶检测。银染和考马斯亮蓝（R250、G250）染色，是蛋白质组研究中最为广泛使用的两种染色方法。;
质谱（massspectrometry，MS）是按照物质的质量与电荷的比值（质荷比，mass-to-chargeratio，m/z）顺序排列成的图谱。
质谱分析法是按照离子的质荷比大小对离子进行分离和测定，从而对样品进行定性和定量分析的一种方法。;质谱仪（massspectrometer）是利用电磁学原理使离子按照质荷比进行分离，从而测定物质的质量与含量的科学实验仪器。;1.基质辅助激光解吸/电离
（matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI）
利用激光脉冲将与基质结晶混合的蛋白质样品升华并电离出来。
2.电喷雾（electrpsprayionization，ESI）
将分析物从溶液中电离出来，可以方便地与液相色谱（liquid-chromatography，LC）联用。;1.分子量测定
2.肽谱测定
生物质谱通过与特异性蛋白酶解相结合，可测定肽质量指纹图（peptidemassfingerprint，PMF），并获得全部肽段的准确分子量，结合蛋白质数据库检索就可实现蛋白质的快速鉴别和高通量筛选。
;3.肽序列测定
串联质谱技术可直接用于肽段的测序，从一级质谱产生的肽段中选择母离子进入二级质谱，经惰性气体碰撞后，肽段沿肽链断裂，由所得各肽段质量数差值推定肽段序列，并用于数据库查寻，称为肽序列标签技术（peptidesequencetag,PST），目前广泛应用于蛋白质组大规模筛选。;4.巯基和二硫键定位
利用生物质谱的准确分子量测定特性，同时结合碘乙酰胺、4-乙烯吡啶等化学试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化以及蛋白质酶切、肽谱技术等，可实现对二硫键和自由巯