分子杂交技术详解演示文稿;优选分子杂交技术;第3页，共123页。;特点：
灵敏度高（1pg互补序列）
速度快（24h）
简单易行
应用：
基因克隆的筛选
酶切图谱制作
基因组中特定基因序列的定量和定性检测
基因突变分析
疾病的诊断、微生物病原体检测;第一节核酸杂交基本原理
第二节核酸探针标记的方法
第三节几种常见的杂交
第四节其他类型杂交介绍
第五节原位杂交;分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。
原理：
应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。
因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。
;1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。;引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
;第9页，共123页。;A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。
;2、复性;复性过程：
第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。;影响复性的因素;分子杂交的基本过程;3、杂交
将处理后结合在硝酸纤维素膜上的待检样品与溶液中的标记探针进行杂交，杂交前要进行预杂交，即用非特异性核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。
4、检测
依据标记探针的方法而异，用放射自显影或免疫组化的方法来进行检测。;影响核酸分子杂交的因素：;预杂交;常用于预杂交的封闭物：;一、核酸探针;核酸探针的类型：
1、寡核苷酸探针
2、基因组DNA探针
3、cDNA探针
4、RNA探针
5、单链DNA探针
;1、寡核苷酸探针：
由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp。
优点：
（1）制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。（2）由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变分析。（3）比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。
缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大。;2、基因组DNA探针：
利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而在文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。PCR方法也可制备DNA探针。在选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列。要尽可能使用基因的编码顺序（外显子）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性。;3、cDNA探针：
由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可。也可利用反向技术制备，即以mRNA为模板逆转录合成第一链cDNA，然后加入一对相应于目的序列两端的PCR引物进行PCR扩增，再电泳分离、纯化，即可得到特定的c